目的:研究水通道蛋白9(Aquaporin 9,AQP9)如何參與肝細(xì)胞肝癌缺氧微環(huán)境中癌細(xì)胞的缺氧應(yīng)答,并初步探討其可能的機(jī)制。方法:(第一部分)本實(shí)驗(yàn)采用低氧三氣培養(yǎng)箱培養(yǎng)構(gòu)建SMMC-7721和Huh-7細(xì)胞缺氧模型。應(yīng)用qRT-PCR和蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)SMMC-7721和Huh-7細(xì)胞AQP9的mRNA和Huh-7細(xì)胞的AQP9蛋白質(zhì)的表達(dá)隨著缺氧時(shí)間的變化情況。應(yīng)用重組慢病毒感染SMMC-7721和Huh-7細(xì)胞,構(gòu)建AQP9過表達(dá)細(xì)胞株(SMMC-7721-AQP9和Huh-7-AQP9),以空載體LV-PWPI作為陰性對(duì)照(SMMC-7721-PWPI和Huh-7-PWPI),然后通過si RNA-AQP9干擾過表達(dá)AQP9細(xì)胞中的AQP9(SMMC-7721-AQP9-siAQP9和Huh-7-AQP9-si AQP9),siNC作為對(duì)照(SMMC-7721-AQP9-si NC和Huh-7-AQP9-siNC)。通過蛋白質(zhì)印跡法和細(xì)胞免疫熒光激光共聚焦檢測(cè)病毒轉(zhuǎn)染的細(xì)胞AQP9的蛋白質(zhì)的表達(dá)水平和定位。通過細(xì)胞增殖活性檢測(cè)法(Cell Counting Kit-8,C...

【文章頁數(shù)】：59 頁

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
英漢縮略語名詞對(duì)照
中文摘要
英文摘要
前言
第一部分 細(xì)胞層面研究缺氧微環(huán)境中AQP9對(duì)肝癌SMMC-7721 和Huh-7 細(xì)胞的增殖和侵襲的影響及其可能的機(jī)制
    1.材料和方法
        1.1 實(shí)驗(yàn)材料
            1.1.1 主要實(shí)驗(yàn)儀器、器材
            1.1.2 主要試劑
            1.1.3 主要試劑的配制
        1.2 實(shí)驗(yàn)方法
            1.2.1 細(xì)胞復(fù)蘇、培養(yǎng)、凍存
            1.2.2 慢病毒轉(zhuǎn)染肝癌SMMC-7721 和Huh-7 細(xì)胞株
            1.2.3 細(xì)胞RNA的提取、逆轉(zhuǎn)錄c DNA的合成和q RT-PCR
            1.2.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR
            1.2.5 細(xì)胞總蛋白的提取和蛋白濃度測(cè)定
            1.2.6 Western Blot
            1.2.7 細(xì)胞缺氧模型的建立
            1.2.8 細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)
            1.2.9 CCK-8 法細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)
            1.2.10 細(xì)胞免疫熒光
            1.2.11 si RNA的轉(zhuǎn)染
            1.2.12 Elisa
            1.2.13 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法
    2 結(jié)果
        2.1 細(xì)胞缺氧模型的構(gòu)建
        2.2 缺氧誘導(dǎo)Huh-7 細(xì)胞中AQP9表達(dá)降低
        2.3 在常氧狀態(tài)下，構(gòu)建過表達(dá) AQP9 的 SMMC-7721-AQP9 和Huh-7-AQP9 細(xì)胞
        2.4 在缺氧微環(huán)境中 AQP9 對(duì) SMMC-7721 和 Huh-7 細(xì)胞增殖和侵襲的抑制作用強(qiáng)于常氧狀態(tài)
        2.5 低氧微環(huán)境中 AQP9 過表達(dá)可抑制 SMMC-7721 和 Huh-7 細(xì)胞HIF-1α的表達(dá)
        2.6 低氧微環(huán)境中表達(dá)增加的 AQP9 可抑制 SMMC-7721 和 Huh-7 細(xì)胞核內(nèi) HIF-1α的表達(dá)
第二部分 通過免疫組織化學(xué)研究AQP9與HIF-1α在肝癌人體標(biāo)本中表達(dá)的相關(guān)性
    1 材料和方法
        1.1 材料
            1.1.1 標(biāo)本的收集
            1.1.2 主要實(shí)驗(yàn)設(shè)備
            1.1.3 主要實(shí)驗(yàn)試劑
        1.2 實(shí)驗(yàn)方法
            1.2.1 免疫組織化學(xué)法
            1.2.2 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法
    2 結(jié)果
第三部分 動(dòng)物皮下成瘤內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究表達(dá)增高的AQP9對(duì)肝癌細(xì)胞裸鼠皮下成瘤和HIF-1α表達(dá)的影響
    1 材料和方法
        1.1 實(shí)驗(yàn)材料
            1.1.1 細(xì)胞和動(dòng)物
            1.1.2 主要實(shí)驗(yàn)儀器設(shè)備
            1.1.3 主要實(shí)驗(yàn)試劑
            1.1.4 主要溶液的配制
        1.2 實(shí)驗(yàn)方法
            1.2.1 裸鼠皮下成瘤實(shí)驗(yàn)
    2 結(jié)果
        2.1 裸鼠皮下成瘤瘤體的觀察及表達(dá)增加的AQP9對(duì)裸鼠皮下成瘤率及生長速度的影響
        2.2 裸鼠皮下成瘤瘤體的免疫組織化學(xué)法檢測(cè)結(jié)果
    3 討論
全文總結(jié)
參考文獻(xiàn)
文獻(xiàn)綜述
    參考文獻(xiàn)
致謝
碩士期間發(fā)表文章



本文編號(hào)：3759816