本文關鍵詞：stTRAIL-納米金復合物促進熱休克肝癌細胞凋亡的實驗研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的和意義:利用化學還原法制備了聚乙烯亞胺修飾的納米金基因載體并研究其理化性質、表征參數及細胞毒性、轉染效率。通過靜電吸附作用將納米金基因載體與含st TRAIL目的基因片段的重組質粒DNA按一定質量比結合構建了st TRAIL-納米金復合物,并應用該復合物聯(lián)合熱休克處理肝癌細胞,觀察其對熱休克肝癌細胞的增殖活性、細胞凋亡等的影響,并探討st TRAIL-納米金復合物促進熱休克肝癌細胞凋亡的相關機制。方法:1.利用化學還原法制備聚乙烯亞胺修飾的納米金基因載體,用紫外分光光度計檢測納米金顆粒的吸收光譜及最大吸收峰處波長,在透射電鏡下觀察納米金顆粒的表觀形貌特征,用激光粒度儀檢測納米金顆粒的粒徑大小及其分布,用表面電位儀檢測納米金顆粒的表面電位(Zeta電位),用1%的瓊脂糖凝膠電泳實驗檢測納米金基因載體與質粒DNA的結合穩(wěn)定性,CCK-8試劑盒檢測聚乙烯亞胺修飾納米金基因載體及DNA-納米金復合物對HEK293細胞的細胞毒性作用,通過熒光顯微鏡觀察聚乙烯亞胺納米基因載體介導p Ac GFP-N1在體外培養(yǎng)的HEK293細胞中的表達,并分析其轉染效率。2.將納米金基因載體與含stTRAIL目的基因片段的重組質粒DNA按不同質量比混合,1%瓊脂糖凝膠電泳實驗檢測st TRAIL-納米金復合物結合的穩(wěn)定性,CCK-8試劑盒檢測其對SMMC7721細胞的細胞毒性,確定納米金與重組質粒DNA結合的最佳質量比。st TRAIL-納米金復合物聯(lián)合熱休克處理肝癌細胞后,用CCK-8試劑盒檢測其對肝癌細胞SMMC7721的增殖活性的影響,并用流式細胞術檢測該復合物聯(lián)合熱休克處理肝癌細胞后促進肝癌細胞凋亡的作用。3.Real-time PCR和Western blot分別檢測TRAIL信號通路下游Caspase-8、Caspase-3的mRNA、蛋白質水平的表達差異,探討st TRAIL-納米金復合物促進熱休克肝癌細胞凋亡的相關機制。結果:1.聚乙烯亞胺還原氯金酸可以得到表面帶正電荷的納米金顆粒,呈單分散球形分布,其粒徑為12.3±3.3 nm。在PH=7.2時,Zeta電位為+(29.7±5.1)m V。1%瓊脂糖凝膠電泳實驗結果表明,當納米金/質粒DNA≥0.5時,質粒DNA可完全結合到納米金表面。體外轉染實驗表明,聚乙烯亞胺修飾納米金基因載體能介導p Ac GFP-N1轉染HEK293細胞并在細胞中表達綠色熒光蛋白,其轉染效率可達25%。2.瓊脂糖凝膠電泳實驗表明,當納米金/質粒DNA≥0.5時,重組質粒DNA可完全結合到納米金顆粒表面。CCK-8試驗表明,納米金與重組質粒DNA按質量比5:1結合時形成的復合物相對穩(wěn)定,且對細胞毒性較弱,最適合轉染st TRAIL基因。用按此比例結合的stTRAIL-納米金復合物聯(lián)合熱休克處理肝癌細胞,能明顯抑制肝癌細胞增殖活性,顯著地促進肝癌細胞凋亡。3.Real-time PCR結果表明,經過st TRAIL-納米金復合物聯(lián)合熱休克處理的肝癌細胞組,TRAIL信號通路下游Caspase-8、Caspase-3的mRNA表達明顯增高。Western blot結果同樣表明,實驗組TRAIL信號信號通路下游Caspase-8、Caspase-3等蛋白質表達明顯上調。結論:通過化學合成的納米金基因載體具備制備簡便、成本低、轉染效率較高的特點。2.st TRAIL-納米金復合物按質量比5:1結合較穩(wěn)定,能夠轉染st TRAIL基因。該復合物能夠在熱休克條件下能夠顯著地抑制肝癌細胞增殖,促進肝癌細胞凋亡。3.st TRAIL-納米金復合物促進熱休克肝癌細胞凋亡可能是通過納米金載體遞送TRAIL基因,使TRAIL基因過表達,上調TRAIL信號通路,促使下游凋亡相關分子Caspase-8、Caspase-3等表達增加,從而促進肝癌細胞凋亡。
【關鍵詞】：肝癌 TRAIL 納米金 熱休克 凋亡
【學位授予單位】：第三軍醫(yī)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R735.7
【目錄】：

• 縮略語表5-7
• 英文摘要7-10
• 中文摘要10-12
• 第一章 前言12-15
• 1.1 研究背景12
• 1.2 研究意義12-13
• 1.3 可行性分析13-14
• 1.4 研究方法14
• 1.5 統(tǒng)計學分析14-15
• 第二章 聚乙烯亞胺修飾納米金基因載體的制備及鑒定15-25
• 2.1 引言15-16
• 2.2 材料與方法16-18
• 2.3 實驗方法18-19
• 2.4 結果19-23
• 2.5 討論23-24
• 2.6 結論24-25
• 第三章 stTRAIL-納米金復合物促進熱休克肝癌細胞凋亡的實驗研究25-45
• 3.1 引言25
• 3.2 材料與方法25-29
• 3.3 實驗方法29-37
• 3.4 實驗結果37-43
• 3.5 討論43-44
• 3.6 結論44-45
• 全文總結45-46
• 參考文獻46-50
• 文獻綜述 TRAIL在肝癌治療中的應用進展50-57
• 參考文獻54-57
• 攻讀學位期間取得的主要研究成果57-58
• 致謝58

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