目的通過幽門螺桿菌（H.pylori）cagA基因敲除、細胞共培養(yǎng)實驗及重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細胞實驗,探討H.pylori CagA蛋白對胃癌上皮細胞絲氨酸/蘇氨酸激酶PIM2表達的影響,為H.pylori致病機制和胃癌診療研究提供基礎(chǔ)。方法1.H.pylori cagA 基因敲除菌株的構(gòu)建:（1）PCR擴增H.pylori NCTC11637菌株cagA基因上下游同源臂片段和質(zhì)粒pNZ8110氯霉素抗性基因片段,應(yīng)用無縫克隆技術(shù)將這些片段插入質(zhì)粒pBluescript Ⅱ SK（-）構(gòu)建cagA基因打靶載體,用PCR、酶切和測序法鑒;重組質(zhì)粒;（2）通過電轉(zhuǎn)化將打靶載體轉(zhuǎn)入NCTC111637,運用含氯霉素培養(yǎng)板篩選陽性轉(zhuǎn)化菌株,經(jīng)PCR、基因測序和Western blot檢測鑒定cagA基因敲除菌株NCTC11637△cagA。2.H.pylori與胃癌細胞共培養(yǎng)實驗:（1）將H.pylori NCTC11637分別與胃癌上皮細胞HGC27、SGC7901和AGS共培養(yǎng)實驗,檢測當感染復(fù)數(shù)（Multiplicity of infection,MOI）,即細菌數(shù):細胞數(shù),分別為50:1、10... 

【文章頁數(shù)】：83 頁

【學位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
英文縮略詞
1 前言
2 材料與方法
    2.1 主要儀器設(shè)備
    2.2 主要生化試劑
    2.3 試劑配制
        2.3.1 菌株、質(zhì)粒和細胞
        2.3.2 主要試劑及配制
    2.4 實驗方法
        2.4.1 技術(shù)路線圖
        2.4.2 H.pylori NCTC11637的培養(yǎng)鑒定及基因組DNA的提取
        2.4.3 H.pylori NCTC11637 cagA基因打靶載體的構(gòu)建
        2.4.4 H.pylori NCTC11637 cagA基因敲除菌株的構(gòu)建及鑒定
        2.4.5 H.pylori NCTC11637 cagA基因真核表達載體的構(gòu)建
        2.4.6 細胞復(fù)蘇、培養(yǎng)傳代和凍存
        2.4.7 H.pylori與細胞共培養(yǎng)實驗
        2.4.8 pcDNA-cagA真核質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細胞實驗
        2.4.9 qPCR檢測細胞PIM2 mRNA的表達
    2.5 統(tǒng)計學分析
3 結(jié)果
    3.1 打靶載體的構(gòu)建及鑒定
        3.1.1 NCTC11637 cagA基因上下游同源臂F1、F2 PCR結(jié)果
        3.1.2 質(zhì)粒pNZ8110氯霉素抗性基因cm~R PCR結(jié)果
        3.1.3 打靶載體PCR和酶切鑒定結(jié)果
        3.1.4 打靶載體測序結(jié)果
    3.2 H.pylori cagA基因敲除菌株的鑒定
        3.2.1 H.pylori菌體尿素酶鑒定和革蘭染色結(jié)果
        3.2.2 敲除菌株P(guān)CR和測序鑒定
        3.2.3 敲除菌株Western Blot鑒定
    3.3 H.pylori cagA基因真核表達載體的構(gòu)建
        3.3.1 H.pylori NCTC111637 cagA基因PCR結(jié)果
        3.3.2 重組質(zhì)粒pcDNA-cagA PCR鑒定
        3.3.3 重組質(zhì)粒pcDNA-cagA測序鑒定
    3.4 H.pylori感染胃黏膜上皮細胞
        3.4.1 H.pylori感染胃上皮細胞不同MOI細胞PIM2的表達
        3.4.2 H.pylori感染胃上皮細胞不同時間細胞PIM2的表達
        3.4.3 NCTC11637和NCTC11637△cagA菌株感染胃癌細胞PIM2的表達
    3.5 pcDNA-cagA轉(zhuǎn)染胃癌細胞
        3.5.1 pcDNA-cagA轉(zhuǎn)染胃上皮細胞后cagA基因的表達
        3.5.2 pcDNA-cagA轉(zhuǎn)染胃上皮細胞后細胞PIM2的表達
4 討論
    4.1 H.pylori NCTC11637 cagA基因敲除菌株的構(gòu)建
    4.2 H.pylori感染與胃癌細胞中PIM2表達的關(guān)系
    4.3 H.pylori CagA蛋白與胃癌細胞中PIM2表達的影響
5 創(chuàng)新與局限
6 結(jié)論
7 參考文獻
綜述 絲氨酸/蘇氨酸激酶PIM2的研究進展
    參考文獻
個人簡歷
致謝


【參考文獻】：
期刊論文
[1]幽門螺桿菌Tipα通過激活I(lǐng)L-6/STAT3信號通路誘導(dǎo)胃癌細胞EMT的形成[J]. 韓亮,陳國棟,曾莎莎,肖玲巧,張潔雅,趙蘭華,蔡恒玲,張艷.  免疫學雜志. 2019(02)
[2]基因組編輯技術(shù)的原理及應(yīng)用[J]. 賀飛燕,閆建俊,馮瑞云,張愛萍,張維鋒,白云鳳.  應(yīng)用與環(huán)境生物學報. 2016(02)
[3]核因子κB信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路與腫瘤關(guān)系的研究進展[J]. 崔哲浩,玄云澤.  世界最新醫(yī)學信息文摘. 2015(21)
[4]幽門螺桿菌對胃癌上皮細胞株AGS細胞的生長抑制作用及其分子機理探討[J]. 高文,胡伏蓮,呂有勇.  中華醫(yī)學雜志. 2003(09)

博士論文
[1]幽門螺桿菌CagA蛋白調(diào)控α-烯醇酶表達的機制[D]. 陳帥印.鄭州大學 2014
[2]幽門螺桿菌細胞毒素相關(guān)基因A蛋白（CagA）致病的分子機制研究[D]. 黃志剛.鄭州大學 2007

碩士論文
[1]PIM2在人類紅系發(fā)育中的功能研究[D]. 楊燦.鄭州大學 2019
[2]幽門螺桿菌CagA與YWHAE相互作用對細胞遷移的影響[D]. 鄭淑蓉.福建醫(yī)科大學 2015
[3]幽門螺桿菌基因敲除方法的建立及其應(yīng)用研究[D]. 韓秀萍.華中農(nóng)業(yè)大學 2010



本文編號：3693692