癌癥已成為當(dāng)前人類死亡的主要疾病,而全球癌癥發(fā)病率與死亡率呈持續(xù)上升趨勢,世界衛(wèi)生組織發(fā)布的報告顯示2012年全球有1400萬人被診斷患癌,罹患人數(shù)最多的3大癌癥分別是肺癌（180萬）、乳癌（170萬）、大腸癌（140萬）。每年全球有420萬人死于癌癥。在2012年,全球新增癌癥病例中超過50%的患者,來自亞洲,而他們中的大部分發(fā)生在中國。此外,中國也是新增肝癌病例的主要國家,由乙型肝炎引起的肝癌中國排在全球首位。因此,深入揭示癌癥發(fā)病機制顯得越來越重要而緊迫,這將有助于開發(fā)更多而有效的癌癥治療藥物。PPARα屬于過氧化物酶體增殖劑激活受體（PPARs）家族中的一員,它在調(diào)節(jié)細胞增殖、凋亡、腫瘤發(fā)生等方面發(fā)揮重要作用。惡性腫瘤的主要特征是細胞異常增生并抑制細胞凋亡。Bcl2家族蛋白包括促進細胞存活蛋白（Bcl2,Bcl-xl,Mcl-1）及促進細胞凋亡蛋白（Bax,Bad,Bim）。基于此,PPARα與抗凋亡Bcl2家族蛋白相關(guān)性機制依然不清楚。本研究發(fā)現(xiàn):PPARα具有E3泛素化連接酶新功能并誘導(dǎo)底物Bcl2蛋白泛素化、降解,從而增強化療藥物誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡并降低其存活率。顯著性發(fā)現(xiàn)... 

【文章來源】：江蘇大學(xué)江蘇省

【文章頁數(shù)】：83 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
第一章緒論
    1.1 過氧化物酶體增殖劑激活受體 �。≒PAR�。�
        1.1.1 PPARα 概論
        1.1.2 PPARα 和腫瘤
    1.2 E3泛素化連接酶
        1.2.1 E3泛素化連接酶概論
        1.2.2 指環(huán)結(jié)構(gòu)域（RING）的一般特征
        1.2.3 大多數(shù)指環(huán)結(jié)構(gòu)域蛋白調(diào)節(jié)泛素的轉(zhuǎn)移
        1.2.4 鑒定E3泛素化連接酶是非常重要的
        1.2.5 鑒定出E3泛素化連接酶的底物是非常重要的
    1.3 B淋巴細胞瘤-2 基因（BCL2）
        1.3.1 Bcl2概論
        1.3.2 Bcl2和腫瘤
    1.4 本研究的意義
    1.5 主要研究內(nèi)容和技術(shù)路線
        1.5.1 主要研究內(nèi)容
        1.5.2 技術(shù)路線
第二章 PPARα 降低Bcl2蛋白水平
    2.1 實驗材料
        2.1.1 實驗細胞系以及質(zhì)粒
        2.1.2 實驗儀器及實驗耗材
        2.1.3 主要實驗試劑及其配制
    2.2 實驗方法
        2.2.1 質(zhì)粒擴增和提取
        2.2.2 細胞培養(yǎng)
        2.2.3 細胞轉(zhuǎn)染
        2.2.4 細胞加藥物處理
        2.2.5 細胞總蛋白提取
        2.2.6 細胞質(zhì)細胞核分離提取
        2.2.7 細胞蛋白濃度的測定
        2.2.8 蛋白質(zhì)免疫印跡法(Western blotting)檢測目標蛋白含量變化
        2.2.9PPARα 對Bcl2基因水平的影響
    2.3 實驗結(jié)果與分析
        2.3.1 PPARα 在不同細胞系中的表達
        2.3.2 PPARα 基因沉默增加Bcl2蛋白水平
        2.3.3 PPARα 基因沉默后，Bcl2的半衰期顯著延長
        2.3.4 過表達PPARα 顯著降低內(nèi)源性和外源性Bcl2蛋白水平
        2.3.5 PARs家族中只有PPARα 降低Bcl2蛋白水平
        2.3.6 PARα 對Bcl2的基因表達無影響
        2.3.7 PPARα 依賴蛋白酶體信號降解Bcl2蛋白
        2.3.8 PPARα 誘導(dǎo)Bcl2降解，縮短其半衰期
        2.3.9 PPARα 激活劑對Bcl2蛋白水平基本無影響
    2.4 本章小結(jié)
第三章 PPARα 作為泛素化連接酶誘導(dǎo)Bcl2泛素化降解
    3.1 實驗材料
        3.1.1 實驗細胞系和質(zhì)粒
        3.1.2 實驗儀器
        3.1.3 主要實驗試劑及其配制
    3.2 實驗方法
        3.2.1 質(zhì)粒擴增和提取
        3.2.2 構(gòu)建PPARα/C102A點突變質(zhì)粒
        3.2.3 細胞培養(yǎng)與處理
        3.2.4 細胞轉(zhuǎn)染
        3.2.5 細胞加藥物處理
        3.2.6 細胞總蛋白提取
        3.2.7 變性免疫共沉淀
        3.2.8 LC/MS/MS分析PPARα 誘導(dǎo)Bcl2泛素化位點
        3.2.9 體外泛素化
    3.3 實驗結(jié)果與分析
        3.3.1 PPARα 顯著增加內(nèi)源性和外源性Bcl2的泛素化
        3.3.2 PPARα 沉默抑制Bcl2的泛素化
        3.3.3 PPARα 蛋白結(jié)構(gòu)中包含RING結(jié)構(gòu)域
        3.3.4 LC/MS/MS分析PPARα 誘導(dǎo)K48-連接的多聚泛素形成
        3.3.5 PPARα 體外泛素化Bcl2
        3.3.6 PPARα/C102A突變體對Bcl2蛋白的半衰期無影響
    3.4 本章小結(jié)
第四章 PPARα 和Bcl2相互作用
    4.1 實驗材料
        4.1.1 實驗細胞系和實驗所需質(zhì)粒
        4.1.2 實驗儀器
        4.1.3 主要實驗試劑及其配制
    4.2 實驗方法
        4.2.1 質(zhì)粒擴增和提取
        4.2.2 細胞培養(yǎng)
        4.2.3 細胞轉(zhuǎn)染
        4.2.4 細胞總蛋白提取
        4.2.5 免疫共沉淀
    4.3 實驗結(jié)果與分析
        4.3.1 PPARα 與Bcl2生理上相互綁定
        4.3.2 PPARα 與Bcl2的BH3結(jié)構(gòu)域相互綁定
        4.3.3 PPARα/C102是PPARα 與Bcl2相互綁定的關(guān)鍵位點
    4.4 本章小結(jié)
第五章 Bcl2的22位賴氨酸殘基是泛素化關(guān)鍵位點
    5.1 實驗材料
        5.1.1 實驗細胞系和質(zhì)粒
        5.1.2 實驗儀器
        5.1.3 主要實驗試劑及其配制
    5.2 實驗方法
        5.2.1 質(zhì)粒擴增和提取
        5.2.2 細胞培養(yǎng)
        5.2.3 細胞轉(zhuǎn)染
        5.2.4 細胞處理
        5.2.5 細胞總蛋白提取
        5.2.6 Western blot，免疫沉淀分析
    5.3 實驗結(jié)果與分析
        5.3.1 PPARα 不能夠泛素化降解Bcl2/K22R突變體
        5.3.2 PPARα 對Bcl2/K22R突變體半衰期基本無影響
    5.4 本章小結(jié)
第六章 PPARα/Bcl2信號增加腫瘤細胞對化療藥物敏感性
    6.1 實驗材料
        6.1.1 實驗細胞系和質(zhì)粒
        6.1.2 實驗儀器
        6.1.3 主要實驗試劑及其配制
    6.2 實驗方法
        6.2.1 質(zhì)粒擴增和提取
        6.2.2 細胞培養(yǎng)
        6.2.3 細胞轉(zhuǎn)染
        6.2.4 篩選穩(wěn)定表達細胞系
        6.2.5 MTT法檢測細胞存活率
        6.2.6 流式細胞儀檢測細胞凋亡
        6.2.7 細胞總蛋白提取
        6.2.8 Western blot分析
    6.3 實驗結(jié)果與分析
        6.3.1 在化療藥物刺激下，PPARα 基因沉默增加細胞存活率
        6.3.2 C102位點對PPARα 降低細胞存活率是十分關(guān)鍵的
        6.3.3 在化療藥物刺激下， PPARα 激活下游凋亡信號
        6.3.4 在化療藥物刺激下，PPARα 基因沉默降低細胞凋亡
        6.3.5 C102位點是PPARα 誘導(dǎo)細胞凋亡的關(guān)鍵位點
    6.4 本章小結(jié)
第七章 總結(jié)
    7.1 PPARΑ 誘導(dǎo)BCL2蛋白水平的降低
    7.2 PPARΑ 作為泛素化連接酶誘導(dǎo)BCL2泛素化降解
    7.3 PPARΑ 和BCL2相互作用
    7.4 BCL2的22位賴氨酸殘基是PPARΑ 誘導(dǎo)BCL2泛素化的關(guān)鍵位點
    7.5 PPARΑ/BCL2信號增加腫瘤細胞對化療藥物敏感性
參考文獻
致謝
在學(xué)期間的學(xué)術(shù)成果
參與課題



本文編號：3574591