結直腸癌致死率和發(fā)病率呈現(xiàn)逐年上升趨勢,是人類第三大惡性腫瘤。除了傳統(tǒng)的手術及放化療手段,基于腫瘤新生抗原的個體化腫瘤疫苗是新興的抗腫瘤療法。腫瘤新抗原源自體細胞突變,由于其在正常組織中不表達而具有腫瘤特異性。目前國內外針對結腸癌新抗原的研究相對較少。相比當前癌癥研究的臨床前免疫缺陷小鼠模型,斑馬魚（Danio rerio）具有與人類基因組高同源、短周期、高通量、體內動態(tài)可視、發(fā)育前期無適應性免疫、以及低成本等優(yōu)勢,逐漸發(fā)展成另一相對快速且具有較高成本效益的人類癌癥體內模型。據(jù)此,本研究旨在構建簡便有效的篩選及鑒定結腸癌新抗原的新平臺,并期望應用該模型獲得候選靶點抗原。我們依賴于斑馬魚異種移植的能力來揭示效靶細胞在其體內的免疫原性及殺傷活性,因此我們（1）構建斑馬魚移植瘤模型,將CM-Dil標記的T2-A24細胞顯微注射入受精后2天（days post fertilization,dpf）的斑馬魚體內,培養(yǎng)4天,發(fā)現(xiàn)T2-A24細胞具有在斑馬魚體內增殖的能力;（2）為了確定合適的效靶細胞比例,顯微注射CM-Dil標記的不同數(shù)量外周血單核細胞（peripheral blood monon... 

【文章來源】：浙江大學浙江省 211工程院校 985工程院校 教育部直屬院校

【文章頁數(shù)】：66 頁

【學位級別】：碩士

【部分圖文】：

T2-A24模式靶細胞在斑馬魚體內呈現(xiàn)增殖潛能CM-Dil染料標記T2-A24細胞，顯微注射100個細胞到2dpf斑馬魚胚胎卵黃囊中

浙江大學碩士學位論文3結果18圖3.2PBMC可在斑馬魚體內穩(wěn)定存在一周左右CM-Dil染料標記PBMC細胞，分別顯微注射1000/500/250個細胞到2dpf斑馬魚胚胎卵黃囊中。在注射后0/2/4/6/8天內，每天統(tǒng)計胚胎的存活率，并隨機選取其中的胚胎，將其置于熒光顯微鏡下觀察。（A）斑馬魚體內異種移植細胞0/2/4/6/8天，具有代表性的斑馬魚模型的熒光圖，放大倍數(shù)均為40×；（B）移植0/2/4/6/8天，各組別斑馬魚胚胎的存活率。3.3構建效靶細胞同時注射-斑馬魚移植瘤免疫干預模型3.3.1AKF9體外免疫原性驗證為了建立構建斑馬魚移植瘤免疫干預模型的方法，我們選擇了文獻中已報道的能與HLA-A*24:02分子強結合的多肽AKF9（AYLEAIHKF）[41]。我們利用T2-binding實驗檢測AKF9與HLA-A*24:02分子的結合力，ELISpot實驗檢測單個細胞水平分泌IFN-γ的CTL數(shù)。實驗結果顯示，AKF9處理組FI值大于1.5，說明AKF9與HLA-A*24:02有強結合力（如圖3.3A），與文獻報道一致。體外誘導T細胞活化實驗進一步檢測AKF9的免疫原性，發(fā)現(xiàn)AKF9處理組斑點數(shù)遠大于Blank組，且P值小于0.05，有統(tǒng)計學意義（如圖3.3B-C）。根據(jù)以上結果，我們認為AKF9如相關文獻報道，具有一定的體外免疫原性，因此可以選為我們建模方法中的陽性肽。

浙江大學碩士學位論文3結果19圖3.3AKF9體外免疫原性驗證T2-A24細胞與AKF9共孵育16-18小時。PMBC負載AKF9，添加IL-2后培養(yǎng)12天，分別收集細胞。（A）對于收集的T2-A24細胞，加入適量的Anti-HLA-A24(Human)mAb-FITC抗體孵育，PBS洗滌后上流式細胞儀檢測AKF9與HLA-A*24:02分子的結合力。其中CEF20為陰性對照，Blank為空白對照。FI為熒光系數(shù)，若FI>1.5，則待測肽與HLA-A分子具有強結合力；1.0<FI<1.5，中等結合力；0.5<FI<1，弱結合力；FI<0.5，無結合力；（B）對于收集的T2-A24和PBMC細胞，用ELISpot試劑盒檢測負載抗原的DC誘導的CTL數(shù)。其中Blank為陰性對照，Medium為空白對照；（C）對（B）的定量統(tǒng)計分析，SFC/106PBMCs表示為反應強度。C中結果表示為Mean±SEM，*p<0.05,**p<0.01，***p<0.001。


本文編號：3573071