癌癥是目前威脅人類健康的重大疾病之一,其發(fā)病率逐年升高,并有年輕化的趨勢。傳統(tǒng)的治療方式如手術(shù)、放療和化療等,并不能徹底根治腫瘤。近來,越來越多的研究表明在多種類型的腫瘤中存在腫瘤干細(xì)胞,這些細(xì)胞在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、抵抗放療和化療以及轉(zhuǎn)移與復(fù)發(fā)中起到重要的作用。有研究表明miRNAs與腫瘤的增殖,干細(xì)胞與腫瘤干細(xì)胞的分化與自我更新等生物學(xué)功能相關(guān)。其中miR-489降低了卵巢癌細(xì)胞SKOV3和OVCAR3經(jīng)順鉑處理后的存活率,在小鼠中,其通過靶向DEK調(diào)控小鼠肌肉干細(xì)胞靜息;此外miR-128通過靶向Bmi-1降低神經(jīng)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的增殖水平等。對miRNA在腫瘤中的調(diào)控機(jī)制的研究,對腫瘤的治療具有重要的意義。由于miR-489在小鼠中參與了干細(xì)胞靜息的調(diào)控,本研究選取miR-489作為我們的研究對象,開展了其在腫瘤細(xì)胞中的功能研究。研究發(fā)現(xiàn)miR-489能夠在人纖維肉瘤細(xì)胞株HT1080中引發(fā)自噬,并且證實(shí)了p38a做為miR-489的靶基因,參與了這種自噬的調(diào)控過程。過表達(dá)了miR-489后,細(xì)胞內(nèi)的p38a, DEK蛋白水平降低,p53的蛋白水平升高。進(jìn)一步我們通過過表達(dá)p38a ... 

【文章來源】：浙江大學(xué)浙江省 211工程院校 985工程院校 教育部直屬院校

【文章頁數(shù)】：128 頁

【學(xué)位級別】：博士

【文章目錄】：
致謝
摘要
Abstract
縮略詞和術(shù)語表
第一章 緒論
    1.1 研究背景
        1.1.1 miRNA的產(chǎn)生及其功能
        1.1.2 miR-489的研究現(xiàn)狀
        1.1.3 p38α的研究現(xiàn)狀
        1.1.4 自噬概述
        1.1.5 腫瘤干細(xì)胞概述
    1.2 展望
    1.3 研究目的、方法、意義
第二章 人miR-489能夠在癌細(xì)胞中誘導(dǎo)細(xì)胞自噬
    2.1 引言
    2.2 材料
        2.2.1 實(shí)驗(yàn)材料
        2.2.2 主要試劑
        2.2.3 主要儀器
    2.3 實(shí)驗(yàn)方法
        2.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)及病毒轉(zhuǎn)染
        2.3.2 小RNA抽提
        2.3.3 cDNA的合成
        2.3.4 miR-489的RT-PCR檢測
        2.3.5 總蛋白抽提
        2.3.6 Western blotting
        2.3.7 細(xì)胞免疫熒光
        2.3.8 miRNA靶基因預(yù)測方法
        2.3.9 雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)
    2.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        2.4.1 人纖維肉瘤HT1080細(xì)胞中miR-489的過表達(dá)
        2.4.2 人纖維肉瘤HT1080細(xì)胞中miR-489轉(zhuǎn)染后導(dǎo)致自噬上升
        2.4.3 在人纖維肉瘤細(xì)胞HT1080中miR-489調(diào)控AMPK/mTOR非依賴的自噬
        2.4.4 人miR-489與p38α存在結(jié)合活性
        2.4.5 人纖維肉瘤HT1080細(xì)胞中miR-489靶向p38α
    2.5 小結(jié)與討論
第三章 人miR-489調(diào)控自噬的信號通路分析
    3.1 引言
    3.2 材料
        3.2.1 實(shí)驗(yàn)材料
        3.2.2 主要試劑
        3.2.3 主要儀器
    3.3 方法
        3.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)及病毒轉(zhuǎn)染
        3.3.2 總蛋白抽提取
        3.3.3 Western blotting
        3.3.4 細(xì)胞免疫熒光
    3.4 結(jié)果
        3.4.1 人纖維肉瘤HT1080細(xì)胞中miR-489影響DEK和p53蛋白
        3.4.2 人纖維肉瘤HT1080細(xì)胞中p38α調(diào)控細(xì)胞自噬的途徑
        3.4.3 人纖維肉瘤HT1080細(xì)胞中DEK調(diào)控細(xì)胞自噬的途徑
    3.5 小結(jié)與討論
第四章 在胃癌干細(xì)胞中,人miR-489對自噬的調(diào)控
    4.1 引言
    4.2 材料
        4.2.1 實(shí)驗(yàn)材料
        4.2.2 主要試劑
        4.2.3 主要儀器
    4.3 實(shí)驗(yàn)方法
        4.3.1 胃癌干細(xì)胞分選
        4.3.2 腫瘤球的無血清培養(yǎng)
        4.3.3 腫瘤球的傳代
        4.3.4 細(xì)胞培養(yǎng)及病毒轉(zhuǎn)染
        4.3.5 總蛋白抽提取
        4.3.6 Western blotting
        4.3.7 細(xì)胞免疫熒光
        4.3.8 基質(zhì)膠三維培養(yǎng)
        4.3.9 石蠟切片
        4.3.10 蘇木精伊紅染色
    4.4 結(jié)果
        4.4.1 胃癌干細(xì)胞的分選
        4.4.2 腫瘤干細(xì)胞的干性驗(yàn)證
        4.4.3 胃癌干細(xì)胞中miR-489調(diào)控p38α導(dǎo)致自噬升高
        4.4.4 轉(zhuǎn)染miR-489后胃癌干細(xì)胞的成球率下降
    4.5 小結(jié)與討論
第五章 胃癌干細(xì)胞的靜息和自噬特征分析
    5.1 引言
    5.2 材料
        5.2.1 實(shí)驗(yàn)材料
        5.2.2 主要試劑
        5.2.3 主要儀器
    5.3 實(shí)驗(yàn)方法
        5.3.1 PKH26染色
        5.3.2 石蠟切片
        5.3.3 石蠟切片的免疫熒光檢測
    5.4 結(jié)果
        5.4.1 靜息胃癌干細(xì)胞的標(biāo)記和鑒定
        5.4.2 靜息胃癌干細(xì)胞的自噬特征分析
        5.4.3 靜息胃癌干細(xì)胞不響應(yīng)AMPK/mTOR信號通路
    5.5 小結(jié)與討論
第六章 結(jié)論與展望
    6.1 結(jié)論
    6.2 展望
參考文獻(xiàn)
附錄1 常用試劑配制一覽表
附錄2 常用分子生物學(xué)方法
附錄3 引物列表
附錄4 人miR-489的靶基因預(yù)測
作者簡歷


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]Detection of tumor stem cell markers in pancreatic carcinoma cell lines[J]. Monika Olempska,Patricia Alice Eisenach,Ole Ammerpohl,Hendrik Ungefroren,Fred Fandrich,Holger Kalthoff.  Hepatobiliary & Pancreatic Diseases International. 2007(01)



本文編號：3545962