過量紫外線照射是導(dǎo)致皮膚癌發(fā)生的重要原因,其中的發(fā)病機(jī)理一直是生物醫(yī)學(xué)研究的重點方向。近年來,對于UV照射引起的基因可變剪接的研究越來越得到重視,因為UV照射應(yīng)激下表達(dá)的基因變異體對于腫瘤的形成有重要促進(jìn)作用。其中,mdm2基因作為一種致癌基因,在多種腫瘤中表現(xiàn)出高水平表達(dá),同時,在腫瘤細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了mdm2基因的多種變異體,這些變異體的出現(xiàn)對于腫瘤的發(fā)生有重要的促進(jìn)作用。并且,有研究證明UVB照射可以有效誘導(dǎo)mdm2基因的可變剪接過程,但是具體的調(diào)控機(jī)制仍然不清楚。剪接因子是一類調(diào)控基因可變剪接的重要蛋白,它們可以通過調(diào)節(jié)基因的可變剪接過程產(chǎn)生不同的基因變異體,從而導(dǎo)致細(xì)胞生理過程的改變。但是剪接因子是否調(diào)控UVB照射引起的mdm2可變剪接過程還沒有研究報道。本論文以hnRNP Al和ASF/SF2兩個重要的剪接因子為研究對象,用細(xì)胞分子生物學(xué)方法檢測了剪接因子hnRNP Al和ASF/SF2在UVB引起的mdm2基因可變剪接過程中的調(diào)節(jié)作用。另外,剪接因子hnRNP Al和ASF/SF2在多種類型的腫瘤中都表現(xiàn)出高表達(dá),被認(rèn)為是一種促進(jìn)癌癥的因子,研究兩因子對于UVB照射的響應(yīng)及細(xì)胞... 

【文章來源】：重慶大學(xué)重慶市 211工程院校 985工程院校 教育部直屬院校

【文章頁數(shù)】：134 頁

【學(xué)位級別】：博士

【文章目錄】：
中文摘要
ABSTRACT
主要縮略詞
1 緒論
    1.1 問題的提出和意義
    1.2 國內(nèi)外研究現(xiàn)狀
        1.2.1 UV照射與基因的可變剪接
        1.2.2 UV照射與細(xì)胞信號通路激活
        1.2.3 UV照射與細(xì)胞自噬
    1.3 本研究的目的及研究內(nèi)容
        1.3.1 本研究的目的
        1.3.2 本研究的主要內(nèi)容
        1.3.3 本研究的創(chuàng)新點
2 UVB引起的mdm2的可變剪接
    2.1 前言
    2.2 實驗儀器、材料與試劑
        2.2.1 實驗儀器
        2.2.2 實驗材料與試劑
    2.3 實驗方法
        2.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)、凍存及復(fù)蘇
        2.3.2 UVB照射
        2.3.3 總RNA的提取及檢測
        2.3.4 RNA反轉(zhuǎn)錄
        2.3.5 RT-PCR檢測基因表達(dá)
        2.3.6 質(zhì)粒構(gòu)建(pcDNA3.1 mdm2-FL and mdm2B)
        2.3.7 質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)染
        2.3.8 CCK-8檢測細(xì)胞存活率
    2.4 實驗結(jié)果
        2.4.1 UVB照射導(dǎo)致了mdm2基因的可變剪接
        2.4.2 pcDNA3.1/mdm2-FL和pcDNA3.1/mdm2 B質(zhì)粒的構(gòu)建
        2.4.3 mdm2-FL和mdm2 B對細(xì)胞在UVB照射后存活率的影響
    2.5 討論
    2.6 本章小結(jié)
3 剪接因子hnRNP A1和ASF/SF2在UVB引起的mdm2可變剪接過程中的調(diào)控作用
    3.1 前言
    3.2 實驗儀器、材料與試劑
        3.2.1 實驗儀器
        3.2.2 材料與試劑
    3.3 實驗方法
        3.3.1 UVB照射
        3.3.2 Western blot
        3.3.3 瞬時轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒及siRNA
        3.3.4 總RNA提取及檢測
        3.3.5 RNA反轉(zhuǎn)錄
        3.3.6 RIP-RT-PCR (RNA沉淀Real-time PCR檢測)
    3.4 實驗結(jié)果
        3.4.1 UVB照射后HaCaT細(xì)胞中剪接因子hnRNPA1和ASF/SF2表達(dá)增加
        3.4.2 通過質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)染過表達(dá)和用siRNA沉默hnRNP A1和ASF/SF2在HaCaT細(xì)胞中的表達(dá)
        3.4.3 hnRNP A1和ASF/SF2的表達(dá)對于mdm2可變剪接的影響
        3.4.4 hnRNP A1可以調(diào)控UVB照射引起的mdm2的可變剪接
    3.5 討論
    3.6 本章小結(jié)
4 剪接因子hnRNP A1和ASF/SF2對UVB劑量和時間的響應(yīng)以及細(xì)胞定位的改變
    4.1 前言
    4.2 實驗儀器、材料與試劑
        4.2.1 實驗儀器
        4.2.2 實驗材料與試劑
    4.3 實驗方法
        4.3.1 UVB照射
        4.3.2 Western blot
        4.3.3 免疫熒光
        4.3.4 細(xì)胞質(zhì)細(xì)胞核蛋白分離
        4.3.5 siRNA轉(zhuǎn)染
        4.3.6 細(xì)胞存活率的測定
    4.4 實驗結(jié)果
        4.4.1 UVB照射劑量及時間對hnRNP A1與ASF/SF2表達(dá)的影響
        4.4.2 免疫熒光檢測UVB照射后hnRNP A1與ASF/SF2的細(xì)胞定位
        4.4.3 Western blot檢測UVB照射后hnRNP A1與ASF/SF2在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中的表達(dá)
        4.4.4 沉默hnRNP A1與ASF/SF2的表達(dá)對HaCaT細(xì)胞在UVB照射后的細(xì)胞存活率的影響
    4.5 討論
    4.6 本章小結(jié)
5 ROS、p53以及NF-к B和Akt通路對于剪接因子hnRNP A1和ASF/SF2表達(dá)的影響
    5.1 前言
        5.1.1 ROS,p53與UVB照射
        5.1.2 NF-κB,Akt信號通路與UVB照射
    5.2 實驗儀器、材料與試劑
        5.2.1 實驗儀器
        5.2.2 實驗材料與試劑
    5.3 實驗方法
        5.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)、凍存及復(fù)蘇
        5.3.2 UVB照射
        5.3.3 藥物處理
        5.3.4 pcDNA 6.0/p53質(zhì)粒轉(zhuǎn)染H1299細(xì)胞
        5.3.5 Western blot
    5.4 實驗結(jié)果
        5.4.1 ROS抑制hnRNPA1和ASF/SF2的蛋白表達(dá)
        5.4.2 p53抑制hnRNPA1和ASF/SF2的蛋白表達(dá)
        5.4.3 NF-κB信號通路與剪接因子的表達(dá)
        5.4.4 Akt信號通路與剪接因子的表達(dá)
    5.5 討論
    5.6 本章小結(jié)
6 剪接因子hnRNP A1、ASF/SF2與UVB引起的細(xì)胞自噬
    6.1 前言
        6.1.1 細(xì)胞自噬
        6.1.2 慢病毒系統(tǒng)
    6.2 實驗儀器、材料與試劑
        6.2.1 實驗儀器
        6.2.2 實驗材料與試劑
    6.3 實驗方法
        6.3.1 UVB照射
        6.3.2 Western blot
        6.3.3 pcDNA3.1-EGFP-LC3B質(zhì)粒的構(gòu)建
        6.3.4 EGFP-LC3B HaCaT穩(wěn)定細(xì)胞株的構(gòu)建
        6.3.5 藥物及饑餓處理
        6.3.6 質(zhì)粒的瞬時轉(zhuǎn)染
    6.4 實驗結(jié)果
        6.4.1 UVB可以導(dǎo)致細(xì)胞自噬的發(fā)生
        6.4.2 LC3B基因的擴(kuò)增及pcDNA3.1-EGFP-LC3B質(zhì)粒的構(gòu)建
        6.4.3 EGFP-LC3B HaCaT穩(wěn)定細(xì)胞株的構(gòu)建
        6.4.4 通過EGFP-LC3B puncta的形成檢測UVB處理導(dǎo)致細(xì)胞自噬的發(fā)生
        6.4.5 饑餓和雷帕霉素引起細(xì)胞自噬發(fā)生
        6.4.6 hnRNPA1和ASF/SF2對細(xì)胞自噬的影響
    6.5 討論
    6.6 本章小結(jié)
7 主要結(jié)論與未來工作展望
    7.1 主要結(jié)論
    7.2 未來工作展望
致謝
參考文獻(xiàn)
附錄 作者在攻讀博士學(xué)位期間科研及發(fā)表論文、專利情況



本文編號：3472327