本文關(guān)鍵詞：染色體驅(qū)動蛋白KIF4A通過與細(xì)胞膜蛋白supervillin的相互作用影響胃癌細(xì)胞的遷移侵襲，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：胃癌是全國范圍內(nèi)致死率最高的惡性疾病之一,胃癌轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致其高致死率的主要因素。目前對于胃癌發(fā)病機(jī)制及其治療方面已有廣泛研究,但是對于胃癌依舊沒有很好的治療方法,胃癌仍然是威脅人類生命健康的重大疾病之一。為了探討臨床胃癌轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制,尋找潛在的有效治療胃癌的分子靶點,我們在前期工作基礎(chǔ)上,深入研究了驅(qū)動蛋白分子KIF4A對胃癌細(xì)胞遷移侵襲的調(diào)控。研究表明,驅(qū)動蛋白分子KIF4A是保證細(xì)胞正常分裂的一個關(guān)鍵蛋白,KIF4A的表達(dá)異常會導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。然而KIF4A參與調(diào)控腫瘤轉(zhuǎn)移過程鮮見報道,我們深入研究了KIF4A蛋白分子對胃癌細(xì)胞的遷移侵襲的調(diào)控作用,進(jìn)而闡明KIF4A在調(diào)控腫瘤轉(zhuǎn)移過程中的分子作用機(jī)制。Supervillin (SVIL)是一種與F-actin結(jié)合的膜蛋白,為外周膜蛋白,普遍表達(dá)于人體各組織,有研究表明,SVIL在腫瘤細(xì)胞的侵襲過程中起到一定的作用,并且通過酵母雙雜交實驗證明了其在細(xì)胞內(nèi)能與KIF4A相結(jié)合,因此猜想是否KIF4A調(diào)控腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移過程的分子機(jī)制與SVIL有關(guān),并對這一假設(shè)做了相關(guān)的實驗驗證。本研究工作從以下幾個方面進(jìn)行展開：1.我們利用脂質(zhì)體2000分別轉(zhuǎn)染pGPU6-GFP-KIF4A 和 pGPU6-GFP-NC質(zhì)粒以及pEGFP-C1、pEGFP-KIF4A 和 pEGFP-SVIL的質(zhì)粒于SGC-7901細(xì)胞中,利用G418進(jìn)行篩選,構(gòu)建出了KIF4A低表達(dá)SGC穩(wěn)篩細(xì)胞株、KIF4A局表達(dá)SGC穩(wěn)篩細(xì)胞株、SVIL高表達(dá)SGC穩(wěn)篩細(xì)胞株以及兩個對照細(xì)胞株,并通過Western Blot和免疫熒光染色鑒定這幾個穩(wěn)篩的細(xì)胞株。2.運(yùn)用KIF4A低表達(dá)胃癌細(xì)胞株和KIF4A高表達(dá)胃癌細(xì)胞株分別進(jìn)行劃痕實驗和Transwell實驗,觀察KIF4A對胃癌細(xì)胞SGC-7901遷移的影響。3.對KIF4A低表達(dá)胃癌細(xì)胞株和KIF4A高表達(dá)胃癌細(xì)胞株進(jìn)行 vinculin染色并進(jìn)行計數(shù),應(yīng)用Origin8.0軟件作圖,觀察KIF4A對胃癌細(xì)胞SGC-7901侵襲的影響。4.分別利用IP技術(shù)和免疫熒光染色技術(shù)證明KIF4A 與 supervillin在分子和細(xì)胞水平上的結(jié)合,為進(jìn)一步研究KIF4A 與 SVIL之間的相互作用奠定了基礎(chǔ)。5.分析研究supervillin分子的功能結(jié)構(gòu)域,利用分子克隆技術(shù)構(gòu)建Flag-SVIL的截短突變體,進(jìn)而可以研究KIF4A與supervillin的哪個功能域結(jié)合。
【關(guān)鍵詞】：胃癌 驅(qū)動蛋白 KIF4A 遷移 侵襲 SVIL 黏著斑 vinculin
【學(xué)位授予單位】：天津師范大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R735.2
【目錄】：

• 摘要4-5
• Abstract5-9
• 第一章 前言9-24
• 1.1 驅(qū)動蛋白(Kinesin)的概述9-10
• 1.2 染色體驅(qū)動蛋白KIF4A的概述10-11
• 1.3 染色體驅(qū)動蛋白KIF4A的主要功能11-14
• 1.3.1 KIF4A在正常細(xì)胞有絲分裂中的作用11
• 1.3.2 KIF4A調(diào)控細(xì)胞骨架微管的動態(tài)不穩(wěn)定性11-13
• 1.3.3 KIF4A在腫瘤形成中的作用13-14
• 1.4 Supervillin(SVIL)的發(fā)現(xiàn)與結(jié)構(gòu)14-15
• 1.5 SVIL在腫瘤細(xì)胞侵襲過程中的作用15-19
• 1.5.1 黏著斑與SVIL15-17
• 1.5.2 細(xì)胞偽足與SVIL17-19
• 1.6 腫瘤轉(zhuǎn)移概述19
• 1.7 腫瘤轉(zhuǎn)移的過程19-20
• 1.8 腫瘤轉(zhuǎn)移的影響因素20-21
• 1.8.1 細(xì)胞黏附因子20
• 1.8.2 血管形成20-21
• 1.8.3 蛋白降解酶21
• 1.9 胃癌及胃癌轉(zhuǎn)移21
• 1.10 細(xì)胞遷移概述21-22
• 1.11 細(xì)胞遷移的過程22-24
• 1.11.1 局部細(xì)胞膜前伸形成偽足22
• 1.11.2 細(xì)胞偽足粘附到基底面22-23
• 1.11.3 細(xì)胞骨架的收縮23
• 1.11.4 細(xì)胞尾部脫粘附及回縮23-24
• 1.12 細(xì)胞侵襲24
• 第二章 材料與方法24-40
• 2.1 實驗材料24-28
• 2.1.1 實驗材料與細(xì)胞株24
• 2.1.2 主要試劑與儀器24-28
• 2.2 實驗方法28-40
• 2.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)28
• 2.2.2 細(xì)胞凍存和復(fù)蘇28-29
• 2.2.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染實驗29-30
• 2.2.4 SGC-790I細(xì)胞株內(nèi)KIF4A蛋白表達(dá)水平檢測30-32
• 2.2.5 穩(wěn)篩細(xì)胞株的構(gòu)建32-33
• 2.2.6 免疫熒光染色33-34
• 2.2.7 細(xì)胞遷移實驗34-35
• 2.2.8 免疫共沉淀(IP)實驗35-36
• 2.2.9 質(zhì)粒構(gòu)建實驗36-40
• 第三章 結(jié)果與分析40-59
• 3.1 KIF4A影響胃癌細(xì)胞遷移40-48
• 3.1.1 KIF4A低表達(dá)與過表達(dá)的SGC穩(wěn)篩細(xì)胞株的構(gòu)建與驗證40-43
• 3.1.2 低表達(dá)KIF4A增強(qiáng)SGC細(xì)胞的遷移運(yùn)動能力43-46
• 3.1.3 過表達(dá)KIF4A降低SGC細(xì)胞的遷移運(yùn)動能力46-48
• 3.2 KIF4A影響胃癌細(xì)胞(SGC)的侵襲48-50
• 3.3 KIF4A與SVIL的關(guān)系研究50-59
• 3.3.1 SVIL過表達(dá)細(xì)胞株(SGC-SVIL)穩(wěn)篩細(xì)胞株的構(gòu)建與驗證50-53
• 3.3.2 SGC-SVIL穩(wěn)篩細(xì)胞株的外源GFP-SVIL與內(nèi)源KIF4A結(jié)合53
• 3.3.3 KIF4A與SVIL在細(xì)胞內(nèi)共定位53-55
• 3.3.3.1 內(nèi)源KIF4A與外源的SVIL在胃癌細(xì)胞(SGC)中共定位53-55
• 3.3.3.2 內(nèi)源SVIL與外源GFP-KIF4A在胃癌細(xì)胞(SGC)中共定位55
• 3.3.4 Flag-SVIL截短突變體的構(gòu)建55-59
• 3.3.4.1 PCR引物設(shè)計55-56
• 3.3.4.2 目的片段及載體的制備56-58
• 3.3.4.3 目的片段與載體連接58-59
• 3.3.4.4 連接后的質(zhì)粒測序59
• 第四章 討論59-63
• 4.1 穩(wěn)篩細(xì)胞株構(gòu)建及鑒定中的問題探討59-61
• 4.1.1 穩(wěn)篩細(xì)胞株構(gòu)建中的問題59-61
• 4.1.2 穩(wěn)篩細(xì)胞株鑒定中問題的探討61
• 4.2 質(zhì)粒構(gòu)建過程中問題的探討61-62
• 4.3 本課題進(jìn)一步的實驗思路探討62-63
• 第五章 結(jié)論63-64
• 參考文獻(xiàn)64-70
• 致謝70

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本文編號：345463