本文關(guān)鍵詞：具有腫瘤靶向的刺激響應(yīng)型聚合物膠束在癌癥治療中的研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：癌癥已然成為嚴重威脅人類生命的一大殺手,化療是目前治療癌癥的主要手段,然而化療藥物普遍存在著水溶性差、毒副作用大、生物利用度低等缺點。針對這些弊端,基于納米載體的藥物傳遞系統(tǒng)(DDS)的研究應(yīng)運而生。其中,聚合物膠束作為一種最常見的DDS的形式,對難溶性化療藥物具有很好的的增溶作用,并且可實現(xiàn)藥物的靶向傳遞及控制釋放。本論文旨在構(gòu)建同時具有腫瘤靶向性及刺激響應(yīng)性的聚合物膠束,對其進行了性能表征、體內(nèi)外腫瘤靶向及治療評價。在論文第二章,我們通過開環(huán)聚合反應(yīng)成功合成了溫度敏感的Pluronic F127-聚D,L-丙交酯(F127-PLA,縮寫為FP)共聚物。通過溶劑揮發(fā)法制備膠束,膠束的LC、EE、粒徑、LCST、不透明溫度和沉淀溫度隨著PLA鏈段的增長而增大或升高；膠束的CMC隨著PLA鏈段的增長而減小。酸性和高溫都能加快藥物從膠束中的釋放,然而只有LCST在37℃與40℃之間的FP100膠束具備體溫下維持穩(wěn)定,高溫下快速釋放藥物的理想釋藥特性。因此,我們選擇FP100膠束修飾葉酸用于細胞實驗的研究,FA-FP100膠束具有與FP100膠束近乎一致的粒徑、形貌、溫敏轉(zhuǎn)變性質(zhì)及釋藥曲線。細胞吞噬實驗表明FA-FP100膠束能選擇性的的被FR過表達的HeLa細胞吞噬,而低表達FR的A549細胞吞噬FP100及FA-FP100膠束的量很少�；钏兰毎旧虯lamar blue法證實FP100與FA-FP100至白膠束具有良好子的細胞相容性,在濃度達到1000μg/mL的情況下3T3細胞與HeLa細胞仍然具有90%以上的存活率；40℃的高溫顯著增加了兩種載藥膠束對HeLa細胞的毒性。Annexin V-FITC/PI對經(jīng)藥物處理的細胞染色后,FACS分析細胞凋亡情況得知,載藥膠束在40℃C比在37℃更多的誘導(dǎo)HeLa細胞凋亡。在論文第三章,我們將葉酸分子修飾在PEG-PCL的親水端,DOX通過酸不穩(wěn)定的腙鍵連接到疏水端,成功合成了一種具有葉酸靶向及pH敏感的鍵合藥物FA-hyd。通過溶劑揮發(fā)法制得粒徑在70 nm左右、呈球形分布的膠束。FA-hyd在pH 5.0腙鍵斷裂,膠束粒徑增大,藥物釋放速率加快,而在中性條件下能夠保持穩(wěn)定。溶血率、凝血時間、細胞毒性的數(shù)據(jù)證實FA-PECL空自膠束具有良好的生物相容性。細胞吞噬及細胞毒性結(jié)果顯示,FA-hyd膠束能夠特異性識別并殺死FR過表達的KB細胞。藥物體內(nèi)分布表明,FA-hyd膠束顯著增加了藥物在腫瘤部位的聚集并減少在正常組織的的濃度。藥代動力學(xué)參數(shù)顯示FA-hyd膠束的AUC是所有組中最大的,CL、Vd是所有組中最小的,τ1/2β也僅次于FA-cbm膠束,充分說明FA-hyd增加了藥物在血液中的循環(huán)時間。給予建立有4T1腫瘤模型的Balb/c小鼠連續(xù)治療后,FA-hyd膠束組腫瘤體積增長最慢,小鼠體重幾乎沒有變化,存活時間最長,表明這種葉酸靶向及pH敏感的鍵合藥物膠束具有最佳的抗腫瘤效果及最高的安全性。治療末期取出小鼠腫瘤,HE染色顯示FA-hyd膠束組的凋亡特征最為明顯,進一步從組織學(xué)水平證實了其藥效。在論文第四章,我們成功合成了葉酸靶向及pH/還原雙敏感mPEG-PLA-ss-PEI/FA-DMMA(PELE/FA-DA),MS軟件模擬了PEI與FA的反應(yīng)過程,證實了FA更有可能修飾在PEI的末端伯胺上,因此更有利于暴露在膠束外殼以識別FR,模擬結(jié)果與實驗表征高度吻合。PELE/FA-DA膠束有效阻止BSA吸附,因此在血液中具有很好的穩(wěn)定性。PELE/FA-DA在pH 6.8酰胺鍵斷裂,膠束粒徑增大,表面電荷由負電荷反轉(zhuǎn)為正電荷,中性條件下則穩(wěn)定存在；在10mM GSH作用下二硫鍵發(fā)生斷裂,PEI從膠束表面脫落,粒徑增大,膠束發(fā)生解體。TEM圖像顯示,PELE/FA-DA膠束在pH 5.0及10 mM GSH作用下,膠束結(jié)構(gòu)遭到破壞,迅速發(fā)生聚集。在酸性和還原性條件下DOX從膠束中的釋放速率遠遠快于在中性或未加入還原劑的環(huán)境。PELE/FA-DA膠束在pH 6.8比在pH 7.4具有更高的細胞內(nèi)在化率及細胞毒性。藥物體內(nèi)分布顯示,PELE/FA-DA膠束顯著增加了藥物在腫瘤的聚集并減少在正常組織的濃度。藥代動力學(xué)參數(shù)表明PELE/FA-DA膠束的AUC是所有組中最大的,CL, Vd是所有組中最小的,τ1/2β也是最長的,說明PELE/FA-DA膠束明顯增加了藥物在血液中的循環(huán)時間。給予建立有4T1腫瘤模型的Balb/c、鼠連續(xù)治療后,PELE/FA-DA載藥膠束組腫瘤體積增長最慢,小鼠體重略微增加,存活時間最長,表明這種葉酸靶向及pHH/還原雙敏感的膠束具有最佳的抗腫瘤效果及最高的安全性。治療末期取出小鼠腫瘤,同樣也是PELE/FA-DA載藥膠束組腫瘤抑制率最高,HE染色和TUNEL染色顯示該組的腫瘤細胞數(shù)量最少、凋亡特征最明顯，凋亡率也最高,進一步從組織學(xué)水平證實了其藥效。論文最后一章是在第四章的基礎(chǔ)上,通過調(diào)節(jié)聚合物之間的比例,設(shè)計了能夠?qū)崿F(xiàn)細胞核靶向的聚合物膠束。同樣以mPEG-PLA-ss-PEI-DMMA (PELESS-DA)作為材料骨架,與第四章不同之處在于mPEG與PLA的分子量及比例不同,我們篩選出mPEG5000-PLA4000這一嵌段共聚物,由此形成的膠束PELA具有可自由穿透核孔的尺寸。將mPEG5000-PLA4000進一步與PEI、DMMA反應(yīng)合成pH/還原雙敏感的聚合物PELEss-DA。通過溶劑揮發(fā)法制備膠束,粒徑在40 nnl左右,LC和EE分別超過10%和70%。隨著環(huán)境pH值降低,膠束zeta電位從負電荷反轉(zhuǎn)為正電荷,粒徑也逐漸增大；10 mM GSH作用下膠束粒徑又逐漸減小,2小時后變得與PELA膠束一樣大小。PELESS-DA經(jīng)10 mM GSH作用后二硫鍵斷裂,PEI殼層從膠束表面脫落。膠束在酸性條件下釋放DOX速率相對在中性條件下較快。PELEss-DA膠束在pH 6.8比在pH 7.4能更快的被MCF-7細胞和MCF-7/ADR細胞攝取,并且能夠攜載DOX進入細胞核,此外載藥膠束在酸性條件下細胞毒性更大。Annexin V-FITC/PI對經(jīng)藥物處理的細胞染色后,FACS分析細胞凋亡情況得知,PELEss-DA載藥膠束在酸性條件下比其它各組更多的誘導(dǎo)MCF-7/ADR細胞凋亡。腫瘤冰凍組織切片的CLSM圖像顯示PELEss-DA載藥膠束在MCF-7/ADR腫瘤的分布量遠遠大于其它各組,并且大部分定位于細胞核。給予建立有MCF-7/ADR腫瘤模型的Balb/c裸鼠連續(xù)治療后,PELEss-DA載藥膠束組腫瘤體積增長最慢,裸鼠體重略微增加,存活時間最長,說明這種核靶向及pH/還原雙敏感的膠束具有最佳的抗腫瘤效果及最高的安全性。治療末期取出裸鼠腫瘤,HE染色和TUNEL染色顯示該組的腫瘤細胞核皺縮、破碎,凋亡特征最明顯,從組織學(xué)水平證實了其藥效。Western blot從蛋白水平顯示PELEss-DA載藥膠束能夠上調(diào)腫瘤促凋亡蛋白Caspase-3的表達并下調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2的表達,RT-PCR進一步從基因水平證實PELEss-DA載藥膠束能夠上調(diào)腫瘤Caspase-3基因的表達并下調(diào)Bcl-2基因的表達。
【關(guān)鍵詞】：腫瘤靶向 刺激響應(yīng) 藥物傳遞 聚合物膠束 癌癥治療
【學(xué)位授予單位】：西南交通大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：TQ460.1
【目錄】：

• 摘要8-11
• ABSTRACT11-15
• 常用縮略詞一覽表15-22
• 第1章 緒論22-54
• 1.1 引言22
• 1.2 納米載體的靶向性22-28
• 1.2.1 被動靶向23-25
• 1.2.2 主動靶向25-28
• 1.3 刺激響應(yīng)型納米載體28-43
• 1.3.1 溫度響應(yīng)29-33
• 1.3.2 pH響應(yīng)33-36
• 1.3.3 還原響應(yīng)36-39
• 1.3.4 其它響應(yīng)39-40
• 1.3.5 雙重或多重響應(yīng)40-43
• 1.4 聚合物膠束43-49
• 1.4.1 聚合物膠束概述43-44
• 1.4.2 聚合物膠束：優(yōu)點以及缺點44-45
• 1.4.3 聚合物膠束內(nèi)核研究45-47
• 1.4.4 聚合物膠束外殼研究47-48
• 1.4.5 多功能聚合物膠束48-49
• 1.5 本論文研究目的、研究內(nèi)容及創(chuàng)新49-54
• 1.5.1 本論文研究目的49
• 1.5.2 本論文研究內(nèi)容49-52
• 1.5.3 本論文主要創(chuàng)新點52-54
• 第2章 葉酸靶向及溫度敏感型聚合物膠束的研究54-84
• 2.1 引言54-55
• 2.2 實驗材料與儀器55-56
• 2.2.1 實驗材料55-56
• 2.2.2 實驗細胞56
• 2.2.3 實驗儀器56
• 2.3 實驗方法56-63
• 2.3.1 葉酸靶向及溫度敏感型共聚物的合成56-58
• 2.3.2 共聚物的表征58
• 2.3.3 膠束的制備與表征58-61
• 2.3.4 細胞吞噬和亞細胞定位61-62
• 2.3.5 體外細胞毒性62-63
• 2.3.6 統(tǒng)計學(xué)分析63
• 2.4 結(jié)果與討論63-83
• 2.4.1 共聚物的合成與表征63-67
• 2.4.2 膠束的制備與表征67-68
• 2.4.3 溫敏性考察68-70
• 2.4.4 體外藥物釋放70-72
• 2.4.5 FA-FP100的表征72-76
• 2.4.6 細胞吞噬和亞細胞定位76-78
• 2.4.7 細胞相容性評價78-79
• 2.4.8 溫度對細胞毒性的影響79-82
• 2.4.9 溫度對細胞凋亡的影響82-83
• 2.5 本章小結(jié)83-84
• 第3章 葉酸靶向及pH敏感型鍵合藥物膠束的研究84-117
• 3.1 引言84-85
• 3.2 實驗材料與儀器85-86
• 3.2.1 實驗材料85
• 3.2.2 實驗細胞和動物85-86
• 3.2.3 實驗儀器86
• 3.3 實驗方法86-94
• 3.3.1 葉酸靶向及pH敏感型鍵合藥物的合成86-88
• 3.3.2 共聚物的表征88-89
• 3.3.3 膠束的制備與表征89-90
• 3.3.4 生物相容性評價90-91
• 3.3.5 細胞吞噬和亞細胞定位91-92
• 3.3.6 體外細胞毒性92
• 3.3.7 動物腫瘤模型的建立及實驗方法92
• 3.3.8 藥物體內(nèi)分布92-94
• 3.3.9 體內(nèi)抗腫瘤活性研究94
• 3.3.10 統(tǒng)計學(xué)分析94
• 3.4 結(jié)果與討論94-115
• 3.4.1 鍵合藥物的合成與表征94-100
• 3.4.2 膠束的制備與表征100-102
• 3.4.3 pH敏感性考察102-104
• 3.4.4 體外藥物釋放104-105
• 3.4.5 生物相容性評價105-106
• 3.4.6 細胞吞噬和亞細胞定位106-109
• 3.4.7 體外細胞毒性109
• 3.4.8 藥物體內(nèi)分布109-112
• 3.4.9 體內(nèi)抗腫瘤活性112-115
• 3.5 本章小結(jié)115-117
• 第4章 葉酸勒向及pH/還原雙敏感型聚合物膠束的研究117-164
• 4.1 引言117-119
• 4.2 實驗材料與儀器119-120
• 4.2.1 實驗材料119
• 4.2.2 實驗細胞和動物119
• 4.2.3 實驗儀器119-120
• 4.3 實驗方法120-130
• 4.3.1 葉酸靶向及pH/還原雙敏感型共聚物的合成120-122
• 4.3.2 共聚物的表征122
• 4.3.3 膠束的制備與表征122-125
• 4.3.4 細胞表面葉酸受體(FR)表達125
• 4.3.5 細胞吞噬和亞細胞定位125-126
• 4.3.6 體外細胞毒性126-127
• 4.3.7 動物腫瘤模型的建立及實驗方法127-128
• 4.3.8 藥物體內(nèi)分布128-129
• 4.3.9 體內(nèi)抗腫瘤活性研究129
• 4.3.10 統(tǒng)計學(xué)分析129-130
• 4.4 結(jié)果與討論130-163
• 4.4.1 共聚物的合成與表征130-137
• 4.4.2 膠束的制備與表征137-138
• 4.4.3 蛋白吸附表征138
• 4.4.4 pH/還原雙敏感性考察138-144
• 4.4.5 體外藥物釋放144-146
• 4.4.6 細胞表面FR表達146-147
• 4.4.7 細胞吞噬和亞細胞定位147-153
• 4.4.8 細胞相容性評價153-155
• 4.4.9 pH對細胞毒性的影響155-157
• 4.4.10 藥物體內(nèi)分布157-160
• 4.4.11 體內(nèi)抗腫瘤活性160-163
• 4.5 本章小結(jié)163-164
• 第5章 核鞭向及pH/還原雙敏感型聚合物膠束的研究164-198
• 5.1 引言164-165
• 5.2 實驗材料與儀器165-167
• 5.2.1 實驗材料165-166
• 5.2.2 實驗細胞和動物166
• 5.2.3 實驗儀器166-167
• 5.3 實驗方法167-175
• 5.3.1 核靶向及pH/還原雙敏感型共聚物的合成167-168
• 5.3.2 共聚物的表征168-169
• 5.3.3 膠束的制備與表征169-170
• 5.3.4 細胞吞噬和亞細胞定位170-171
• 5.3.5 體外細胞毒性171-172
• 5.3.6 動物腫瘤模型的建立及實驗方法172
• 5.3.7 藥物腫瘤組織分布172-173
• 5.3.8 體內(nèi)抗腫瘤活性173-174
• 5.3.9 統(tǒng)計學(xué)分析174-175
• 5.4 結(jié)果與討論175-196
• 5.4.1 共聚物的合成與表征175-178
• 5.4.2 膠束的制備與表征178-179
• 5.4.3 pH/還原雙敏感性考察179-183
• 5.4.4 體外藥物釋放183-184
• 5.4.5 細胞吞噬和亞細胞定位184-186
• 5.4.6 細胞相容性評價186-188
• 5.4.7 pH對細胞毒性的影響188-189
• 5.4.8 pH對細胞凋亡的影響189-191
• 5.4.9 藥物腫瘤組織分布191-192
• 5.4.10 體內(nèi)抗腫瘤活性192-196
• 5.5 本章小結(jié)196-198
• 結(jié)論與展望198-200
• 致謝200-202
• 參考文獻202-231
• 攻讀博士學(xué)位期間發(fā)表的論文及科研成果231-23

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1 曹東;易s

本文編號：277314