【摘要】：食管癌是河北省常見的消化道腫瘤,但由于其本病起病隱匿,早期診斷率低,多數(shù)患者診斷時即已是晚期而喪失了手術(shù)治療機會,化療是晚期食管癌治療的重要手段之一。但是由于食管癌治療缺乏靶向性藥物,患者存在明顯的化療耐藥現(xiàn)象,治療效果不理想。microRNAs近年來在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域備受關(guān)注,在不同腫瘤中可以發(fā)揮癌基因或抑癌基因的功能。microRNA-153-3p是新近發(fā)現(xiàn)的與腫瘤密切相關(guān)的抑癌基因,在肝癌和黑色素瘤等惡性腫瘤中低表達,通過靶向Snail抑制腫瘤細胞的浸潤和轉(zhuǎn)移。另外,文獻報道在中樞神經(jīng)系統(tǒng),抑制microRNA-153-3p通過靶向Nrf-2保護缺血所導(dǎo)致的神經(jīng)細胞損傷;Nrf-2可以通過上調(diào)抗氧化蛋白HO-1或SOD-2而保護細胞抗氧化損傷。但是,microRNA-153-3p在食管癌中是否發(fā)揮抑癌基因作用?是否通過Nrf-2/SOD-2或Snail發(fā)揮作用影響食管癌細胞增殖侵襲和化療敏感性還不清楚。本研究主要探討microRNA-153-3p是否通過相應(yīng)的靶蛋白Snail或者Nrf-2/SOD-2影響食管癌細胞遷移、增殖和化療敏感性,旨在為提高食管癌治療療效提供可行的靶標(biāo)分子。第一部分microRNA-153-3p調(diào)控Nrf-2/SOD-2對食管癌細胞增殖和順鉑化療敏感性的影響目的:文獻報道m(xù)icroRNA-153-3p通過靶向Nrf-2介導(dǎo)神經(jīng)細胞增殖和損傷。本研究擬探討microRNA-153-3p是否通過靶蛋白Nrf-2調(diào)控抗氧化損傷蛋白SOD-2而影響食管鱗癌細胞增殖和順鉑化療敏感性。方法:1)細胞水平上,探討轉(zhuǎn)染microRNA-153-3p模擬物或Nrf-2si RNA對食管癌細胞Eca109細胞存活率、克隆形成、SOD-2和Nrf-2表達的影響。采用報告基因檢測microR-153-3p與Nrf-2 mRNA的3’-UTR區(qū)的結(jié)合情況。2)探討轉(zhuǎn)染microRNA-153-3p模擬物或Nrf-2 siRNA對Eca109細胞順鉑(DDP)化療敏感性的影響。3)收集河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院病理科60例食管鱗癌石蠟標(biāo)本,在整體和細胞水平上探討食管癌中Nrf-2對SOD-2的調(diào)控作用。結(jié)果:1.microRNA-153-3p對食管鱗癌細胞增殖的影響體外轉(zhuǎn)染microRNA-153-3p模擬物上調(diào)食管鱗癌細胞Eca109中microRNA-153-3p表達(P0.05)。microRNA-153-3p過表達食管癌細胞其存活率和克隆形成明顯低于對照組細胞(P0.05),并下調(diào)增殖相關(guān)蛋白CyclinD1和Survivin的表達。2.microRNA-153-3p對食管鱗癌細胞順鉑化療敏感性的影響轉(zhuǎn)染microRNA-153-3p模擬物后,microRNA-153-3p過表達細胞DDP的IC_(50)明顯低于對照組(P0.05);DDP明顯抑制microRNA-153-3p過表達食管癌細胞增殖、增加細胞凋亡率和cleave-caspase3的表達(P0.05),上調(diào)microRNA-153-3p表達增加Eca109對于DDP的化療敏感性。3.microRNA-153-3p通過抑制靶蛋白Nrf-2抑制食管鱗癌細胞增殖25對新鮮食管鱗癌標(biāo)本中micro RNA-153-3p低表達與Nrf-2 mRNA高表達具有相關(guān)關(guān)系。過表達microRNA-153-3p明顯抑制腫瘤細胞Nrf-2表達,報告基因檢測顯示microRNA-153-3p結(jié)合Nrf-2 3’UTR區(qū)。采用si RNA敲低Eca109細胞Nrf-2表達明顯抑制細胞增殖、克隆形成以及CyclinD1和Survivin的表達(P0.05)。4.Nrf-2對食管鱗癌細胞順鉑化療敏感性的影響采用siRNA敲低Eca109細胞Nrf-2表達后,不同劑量DDP明顯促進細胞死亡,DDP的IC_(50)明顯低于對照組(P0.05);FCM顯示DDP促進Nrf-2 siRNA細胞凋亡作用(P0.05),提示抑制Nrf-2增加食管癌細胞對DDP化療敏感性。5.食管癌組織中Nrf-2、CyclinD1、Survivin和SOD-2表達的研究60例病理科存檔食管鱗癌標(biāo)本檢測發(fā)現(xiàn)Nrf-2與CyclinD1、Survivin和SOD-2具有明顯正相關(guān)關(guān)系。Kaplan-Meier生存曲線顯示:Nrf-2與患者不良預(yù)后密切相關(guān),是食管癌預(yù)后的獨立因素(P0.05)。6.microRNA-153-3p和Nrf-2對SOD-2表達的影響在25對新鮮食管鱗癌標(biāo)本中microRNA-153-3p與SOD-2 mRNA表達沒有相關(guān)性。上調(diào)microRNA-153-3p或抑制Nrf-2表達對Eca109細胞SOD-2沒有影響。小結(jié):食管癌組織中microRNA-153-3p低表達與Nrf-2高表達有明顯的負(fù)相關(guān)關(guān)系。microRNA-153-3p可以直接結(jié)合于Nrf-2 mRNA的3’-UTR區(qū),通過抑制Nrf-2增加食管癌細胞對DDP的化療敏感性。第二部分TNF-α上調(diào)SOD-2介導(dǎo)食管鱗癌細胞增殖的研究目的:研究中我們發(fā)現(xiàn)上調(diào)microRNA-153-3p或抑制Nrf-2表達對Eca109細胞SOD-2表達沒有影響,本研究我們擬繼續(xù)探討食管癌中SOD-2高表達在腫瘤細胞增殖和順鉑化療中的作用以及腫瘤微環(huán)境中TNF-α對SOD-2的調(diào)控作用。方法:1)收集食管鱗癌臨床標(biāo)本60例,檢測TNF-α、SOD-2、CyclinD1和Survivin的表達情況;2)體外培養(yǎng)Eca109細胞,分析TNF-α通過NF-κB途徑對SOD-2表達的影響及其對細胞增殖的影響;3)觀察SOD-2在DDP誘導(dǎo)食管癌細胞損傷中的作用。結(jié)果:1.食管鱗癌中SOD-2、TNF-α、Cyclin D1和Survivin的表達及臨床病理意義60例人食管鱗癌標(biāo)本SOD-2表達高于癌旁對照組。Kaplan-Meier生存曲線顯示:SOD-2是食管癌預(yù)后的獨立因素,其高表達患者的總體生存率顯著降低。SOD-2與TNF-α、Cyclin D1和Survivin高表達密切相關(guān)。2.炎癥細胞因子TNF-α誘導(dǎo)食管鱗癌細胞的增殖細胞水平,給予TNF-α促進Eca109細胞存活及克隆形成(P0.05),并上調(diào)SOD-2、Cyclin D1和Survivin表達(P0.05)。3.SOD-2介導(dǎo)TNF-α對食管鱗癌細胞的增殖的影響采用siRNA抑制Eca109細胞SOD-2表達后,TNF-α促進細胞增殖、克隆形成、上調(diào)CyclinD 1和Survivin作用明顯受到抑制(P0.05)。提示TNF-α通過上調(diào)SOD-2促進食管鱗癌細胞的增殖。4.TNF-α通過NF-κB信號通路介導(dǎo)SOD-2的表達和細胞增殖采用siRNA抑制Eca109細胞NF-κB表達,TNF-α促進細胞增殖、克隆形成、上調(diào)SOD-2作用受到抑制(P0.05)。提示TNF-α通過NF-κB通路上調(diào)SOD-2而介導(dǎo)食管鱗癌細胞的增殖。5.食管鱗癌中SOD-2表達對順鉑化療敏感性的影響采用siRNA抑制Eca109細胞SOD-2表達后,不同劑量DDP明顯促進SOD-2低表達細胞死亡,DDP的IC_(50)明顯低于對照組(P0.05)。FCM結(jié)果顯示DDP促進SOD-2低表達細胞凋亡(P0.05)。小結(jié):食管鱗癌組織中SOD-2高表達與TNF-α密切相關(guān),與腫瘤患者不良生存密切相關(guān);體外研究發(fā)現(xiàn)SOD-2高表達增加食管鱗癌細胞順鉑化療耐藥性;TNF-α通過NF-κB通路上調(diào)SOD-2表達,促進食管癌細胞增殖。第三部分microRNA-153-3p靶向調(diào)控Snail表達參與食管癌細胞侵襲轉(zhuǎn)移的研究目的:在前面研究基礎(chǔ)上,探討microRNA-153-3p是否調(diào)控Snail介導(dǎo)食管癌細胞侵襲轉(zhuǎn)移。方法:1)采用Meta分析115對食管癌組織及其癌旁標(biāo)本microRNA-153-3p和Snail表達相關(guān)性;采用RT-PCR方法檢測25對新鮮食管鱗癌標(biāo)本microRNA-153-3p和Snail表達;2)培養(yǎng)食管癌細胞OE-21,采用報告基因檢測microR-153-3p與Snail mRNA的3’-UTR區(qū)的結(jié)合情況;3)觀察過表達microR-153-3p對OE-21細胞Snail和遷移的影響;4)采用小動物成像系統(tǒng)觀察過表達microR-153-3p食管癌細胞裸鼠肺部腫瘤形成情況。結(jié)果:1.食管癌中micro RNA-153-3p與Snail相關(guān)性的研究Meta分析115對食管癌組織及其癌旁標(biāo)本顯示microRNA-153-3p低表達與Snail高表達具有負(fù)相關(guān)性;收集25對新鮮食管鱗癌標(biāo)本證實microRNA-153-3p低表達,Snail mRNA高表達,兩者之間具有明顯的負(fù)相關(guān)關(guān)系。2.microRNA-153-3p抑制靶蛋白Snail表達相比較正常食管上皮細胞Het-1,食管癌細胞OE-21中microRNA-153-3p低表達,Snail高表達;而上調(diào)OE-21細胞microRNA-153-3p抑制Snail蛋白表達(P0.05)。報告基因檢測表明microRNA-153-3p可以直接結(jié)合于Snail mRNA的3’-UTR區(qū)。3.microRNA-153-3p在食管癌細胞遷移中的作用OE-21細胞轉(zhuǎn)染microRNA-153-3p模擬物后,細胞遷移數(shù)目減少,Snail、Vimentin、MMP-9表達降低,E-cadherin表達升高(p0.05),microRNA-153-3p通過下調(diào)Snail而抑制食管癌細胞遷移。4.microRNA-153-3p抑制食管癌細胞肺轉(zhuǎn)移采用小動物成像系統(tǒng)觀察食管癌細胞肺部轉(zhuǎn)移癌形成情況,注射microRNA-153-3p模擬物食管癌細胞肺部轉(zhuǎn)移癌明顯低于對照組。小結(jié):食管鱗癌標(biāo)本中microRNA-153-3p低表達與Snail mRNA高表達具有明顯的負(fù)相關(guān)性。microRNA-153-3p結(jié)合Snail mRNA 3’-UTR,下調(diào)Snail而抑制食管癌細胞遷移,減少裸鼠食管癌細胞肺部轉(zhuǎn)移癌形成。結(jié)論:1.食管癌組織中microRNA-153-3p表達與Nrf-2表達顯著負(fù)相關(guān)。microRNA-153-3p直接結(jié)合于Nrf-2 mRNA的3’-UTR區(qū),抑制Nrf-2表達,并增加食管癌細胞對DDP的化療敏感性。2.食管鱗癌組織中SOD-2高表達與TNF-α密切相關(guān),與腫瘤患者不良生存密切相關(guān);SOD-2高表達增加食管鱗癌細胞順鉑化療耐藥性;TNF-α通過NF-κB通路上調(diào)SOD-2表達,促進食管癌細胞增殖。3.食管鱗癌標(biāo)本中microRNA-153-3p低表達與Snail mRNA高表達具有明顯的負(fù)相關(guān)性。microRNA-153-3p結(jié)合Snail mRNA 3’-UTR下調(diào)Snail而抑制食管癌細胞遷移,減少裸鼠食管癌細胞肺部轉(zhuǎn)移癌形成。
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R735.1
【圖文】：

圖 1 microRNA-153-3p 對食管鱗癌細胞增殖的影響Fig.1 The effects of microRNA-153-3p on the cell proliferation in ESCCEca109 cells were transfected with control or microRNA-153-3p mimics fo

圖 2 microRNA-153-3p 對食管鱗癌細胞順鉑化療敏感性的影響ig.2 The effects of microRNA-153-3p on the chemosensitivity of ESCCcisplatin in vitro

圖 3 microRNA-153-3p 通過抑制靶蛋白 Nrf-2 抑制食管鱗癌細胞增殖Fig.3 MicroRNA-153-3p inhibits cell proliferation by targeting Nrf-2 inESCC) Twenty-five ESCC samples and matched para-carcinoma were obtai

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本文編號：2765224