發(fā)布時間：2020-07-22 02:46

【摘要】：研究背景胃癌是一種源自胃黏膜上皮的惡性腫瘤,近年來,胃癌發(fā)病率在全球范圍內(nèi)有所下降,但在中國胃癌的發(fā)病率和死亡率均高居第二位,對人類健康依然有嚴重的威脅。胃癌的發(fā)生發(fā)展是一個復雜的、多因素參與的過程,基因表達調(diào)控的異常在胃癌的發(fā)生中發(fā)揮關(guān)鍵作用。對基因最主要的調(diào)控發(fā)生在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平,最終表達的蛋白產(chǎn)物可直接或間接地作用于調(diào)控細胞增殖、凋亡、遷移等重要生物學功能的信號通路而發(fā)揮作用。目前,蛋白翻譯水平的調(diào)控,尤其是對翻譯起始步驟的研究,已經(jīng)證明真核翻譯起始因子eIFs(eukaryotic initiation factors)能通過對蛋白翻譯和細胞周期的調(diào)控,在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮關(guān)鍵性的作用。真核翻譯起始因子eIF3是eIFs中最復雜,也是最重要的一個多亞基復合物,目前已確定包含的亞單位有13個(eIF-3a,-3b,-3c...-3m)。eIF3通過與其它翻譯起始因子的相互作用促使43S核糖體復合物前體的形成,進而結(jié)合mRNA,識別起始密碼子AUG,在翻譯起始過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。這一功能主要借助于eIF3的核心亞基eIF3a、eIF3b、eIF3e、eIF3f、eIF3h以及eIF3i,研究發(fā)現(xiàn),這6個亞基在眾多腫瘤中均有異常表達,與腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)。eIF3b由于其結(jié)構(gòu)的特殊性,在eIF3復合物中起著腳手架功能,人類eIF3b帶有RNA識別序列(RRM),位于蛋白質(zhì)N端,RRM結(jié)構(gòu)域可以提供一個特定位點,使eIF3b與eIF3J等其它亞基相互作用。目前,大量研究提示eIF3b通過對蛋白翻譯的調(diào)控參與細胞周期、凋亡、細胞侵襲和遷移等癌癥相關(guān)信號通路,影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展。eIF3b已被證明在前列腺癌和膀胱癌中過表達,以及它的過度表達與癌癥預后有關(guān);eIF3b沉默表達能抑制結(jié)腸癌細胞和成膠質(zhì)細胞瘤細胞的增殖;eIF3b在骨肉瘤、食管鱗狀細胞癌和腎細胞癌中均異常表達,對癌細胞的侵襲和遷移起到了推動作用。然而,eIF3b在胃癌中的表達情況及其在胃癌的發(fā)生發(fā)展中是否發(fā)揮作用目前尚無報道。因此,本實驗研究了 eIF3b在胃癌中的表達情況及其在胃癌發(fā)生發(fā)展中的作用。實驗目的研究eIF3b在胃癌細胞和組織中的表達情況及其對胃癌細胞增殖和轉(zhuǎn)移的作用及機制,探討eIF3b作為胃癌診斷標志物和治療靶點的潛在價值。1.eIF3b對胃癌細胞增殖、侵襲和遷移的影響QRT-PCR檢測不同的胃癌細胞系(SGC7901、BGC823、MGC803、AGS和HGC27)中eIF3b mRNA的表達水平。利用eIF3b的小干擾RNA轉(zhuǎn)染至eIF3b mRNA表達水平較高的兩個細胞系SGC7901和MGC803中,用QRT-PCR和Western blot檢測其對eIF3b基因表達的干擾效果,通過克隆形成實驗和CCK8細胞活力實驗檢測下調(diào)eIF3b對胃癌細胞增殖能力的影響;通過Transwell遷移實驗和細胞劃痕實驗檢測下調(diào)eIF3b對胃癌細胞遷移能力的影響;通過Transwell基質(zhì)膠侵襲實驗檢測下調(diào)eIF3b對胃癌細胞侵襲能力的影響。2.動物實驗檢測eIF3b在體內(nèi)對胃癌細胞增殖和轉(zhuǎn)移的影響利用慢病毒(Lentivirus)包被的eIF3b的干擾載體處理胃癌細胞SGC7901,可有效將外源基因整合到宿主染色體上,從而持久性的下調(diào)eIF3b的表達,QRT-PCR 檢測干擾效率,將 Lentivirus-negative control 和 Lentivirus-eIF3b 感染成功的SGC7901細胞分別接種到裸鼠皮下和尾靜脈,觀察裸鼠皮下成瘤和腫瘤肺部轉(zhuǎn)移情況,觀察在體內(nèi)下調(diào)eIF3b對胃癌細胞增殖和轉(zhuǎn)移的影響。3.eIF3b調(diào)控胃癌相關(guān)信號通路中重要基因的表達慢病毒包被的eIF3b的干擾載體感染胃癌細胞SGC7901和MGC803,Western blot和ELISA檢測能影響胃癌細胞增殖、侵襲和遷移相關(guān)的信號通路中重要基因的表達情況,包括 p27、E2F1、AKT、IL-8、Vimentin、CyclinD、CyclinE 和β-catenin等。根據(jù)檢測結(jié)果,選擇下調(diào)比較明顯的E2FI分子進行后續(xù)的拯救實驗,將高表達的E2F1質(zhì)粒和eIF3b的特異性小干擾共轉(zhuǎn)染到SGC7901和MGC803細胞中,設置 si-NC + pcDNA-NC、si-eIF3b + pcDNA-NC、si-eIF3b + pcDNA-E2F13組分別進行克隆形成和Transwell實驗,驗證下調(diào)eIF3b的表達能夠直接或間接地調(diào)控胃癌相關(guān)信號通路中重要基因的表達從而影響胃癌細胞的增殖和轉(zhuǎn)移。4.eIF3b在人慢性胃炎和胃癌組織標本中的表達QRT-PCR檢測39例人慢性胃炎和正常胃粘膜組織標本以及46對胃癌和遠端癌旁組織標本中eIF3b的mRNA表達水平,免疫組化檢測胃癌組織切片中eIF3b的蛋白表達水平,分析eIF3b的表達水平與胃癌患者相關(guān)病理參數(shù)的相關(guān)性,評估其是否能作為胃癌的潛在診斷標志物。5.幽門螺桿菌感染對胃癌細胞中eIF3b表達的影響幽門螺桿菌Hp11637和Hp26695,按照MOI 1:100,感染胃癌細胞AGS,對照組加PBS,分別在幽門螺桿菌感染細胞后6h、12h和24h收取細胞,QRT-PCR檢測各組中eIF3bmRNA表達水平;再用Hp11637和Hp26695,按照MOI 1:50、1:100和1:150分別感染AGS細胞,12h后收取細胞,QRT-PCR和Western blot分別檢測各組中eIF3b的mRNA和蛋白表達水平。實驗結(jié)果1.下調(diào)eIF3b的表達抑制胃癌細胞的增殖、侵襲和遷移QRT-PCR檢測結(jié)果顯示,eIF3b mRNA表達水平在胃癌細胞系SGC7901和MGC803中明顯高于其它幾種胃癌細胞系;用eIF3b特異性siRNA轉(zhuǎn)染胃癌細胞SGC7901和MGC803,與轉(zhuǎn)染的對照組(siRNA-negative control)相比,實驗組中eIF3b mRNA和蛋白水平均明顯下降�？寺⌒纬蓪嶒灲Y(jié)果顯示,下調(diào)eIF3b的表達顯著抑制胃癌細胞SGC7901和MGC803的克隆形成能力;CCK8細胞活力實驗結(jié)果顯示,下調(diào)eIF3b顯著抑制SGC7901和MGC803的增殖能力;Transwell基質(zhì)膠侵襲實驗結(jié)果顯示,下調(diào)eIF3b的表達顯著抑制胃癌細胞SGC7901和MGC803的侵襲能力;Transwell遷移實驗和細胞劃痕實驗結(jié)果顯示,下調(diào)eIF3b的表達顯著抑制胃癌細胞SGC7901和MGC803的遷移能力。2.下調(diào)eIF3b的表達在體內(nèi)抑制了胃癌細胞的增殖和轉(zhuǎn)移QRT-PCR 和 Western blot 檢測 Lentivirus-eIF3b 可有效下調(diào) SGC7901 細胞中eIF3b mRNA的表達水平。皮下注射胃癌細胞的裸鼠,5天后,對照組觀察到較為明顯的微小瘤體,9天后,開始測量瘤體大小,19天后處死裸鼠,瘤體的實體觀察和生長曲線表明,與對照組相比,下調(diào)eIF3b的表達能抑制裸鼠體內(nèi)瘤體的增殖。尾靜脈注射胃癌細胞的裸鼠,兩個月后處死,取出肺組織,經(jīng)動物活體成像儀拍攝顯示,對照組比實驗組有更嚴重的肺部轉(zhuǎn)移現(xiàn)象。肺組織實體觀察和稱重顯示,對照組腫瘤結(jié)節(jié)數(shù)目多、體積大,肺的重量明顯大于干擾組。肺部瘤體切片HE染色結(jié)果顯示,在裸鼠肺部對照組比實驗組癌細胞浸潤明顯。3.下調(diào)eIF3b的表達影響胃癌相關(guān)信號通路中重要基因的表達Western blot檢測結(jié)果顯示,下調(diào)eIF3b的表達,在SGC7901和MGC803細胞中抑制了與胃癌細胞增殖和轉(zhuǎn)移相關(guān)的基因E2F1、CyclinD、CyclinE、Vimentin和β-catenin的蛋白表達水平,升高了抑癌基因p27的蛋白表達水平。ELISA結(jié)果顯示,下調(diào)eIF3b的表達,抑制了 SGC7901細胞中IL-8的蛋白表達水平,升高了 MGC803細胞中IL-8的蛋白表達水平。表明下調(diào)eIF3b的表達可能通過對p27、E2F1、CyclinD、CyclinE、Vimentin、β-catenin 和 IL-8 的調(diào)控從而影響胃癌細胞的增殖和轉(zhuǎn)移。拯救實驗結(jié)果顯示,下調(diào)eIF3b的表達對SGC7901和MGC803細胞增殖和遷移的抑制作用部分依賴于E2F1。4.eIF3b在人慢性胃炎和胃癌組織標本中高表達QRT-PCR結(jié)果顯示eIF3b mRNA在人慢性胃炎組織中的表達水平比在正常胃黏膜組織中的表達水平高,而且在Hp陽性(Hp+)胃炎組織中的表達水平比在Hp陰性(Hp-)胃炎組織中的表達水平高。QRT-PCR結(jié)果顯示eIF3bmRNA在胃癌組織中的表達水平比在正常胃組織中的表達水平高,而且表達水平與胃癌患者的臨床病理分期相關(guān)。免疫組化結(jié)果顯示與癌旁正常組織相比,胃癌組織中eIF3b蛋白表達水平明顯增高,而且eIF3b主要在細胞質(zhì)中表達。5.幽門螺桿菌Hp11637和Hp26695能夠上調(diào)胃癌細胞中eIF3b的表達水平QRT-PCR結(jié)果顯示,Hp11637和Hp26695以MOI1:100感染胃癌細胞AGS,感染12h后AGS細胞中eIF3b的mRNA表達水平明顯升高;幽門螺桿菌毒力因子CagA可明顯上調(diào)AGS細胞中eIF3b的表達。Hp11637和Hp26695分別以MOI 1:50、1:100和1:150感染胃癌細胞AGS,感染12h后細胞中eIF3b的mRNA和蛋白表達水平逐漸上調(diào)。實驗結(jié)論1.eIF3b能夠通過調(diào)控腫瘤相關(guān)通路中的重要分子在體外促進胃癌細胞的增殖、侵襲和遷移。2.eIF3b在動物體內(nèi)可以促進胃癌細胞的增殖和轉(zhuǎn)移。3.eIF3b在人慢性胃炎和胃癌組織中表達升高,且與胃癌的分期相關(guān),提示eIF3b可能作為一種新的胃癌診斷標志物。4.幽門螺桿菌感染可上調(diào)胃癌細胞中eIF3b的表達,提示eIF3b可能參與幽門螺桿菌的致癌過程。
【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R735.2
【圖文】：

山東大學碩士學位論文的相對分子質(zhì)量為５５０－７００ＫＤａ，目前己確定的亞單位有１３（ｅＩＦ３ａ，ｅＩＦ３ｂ．．．ｅＩＦ３ｍ）邋［１５］。在真核細胞蛋白質(zhì)翻譯起始過程中，ｅＩＦ３結(jié)合０Ｓ核糖體亞基上，通過與ｅＩＦ４等其它亞基之間的相互作用促使４３Ｓ核糖體合物前體的形成［１６］；邋ｅＩＦ３還參與對重起始的掃描以及對起始密碼子ＡＵＧ的別過程［１７］。研究發(fā)現(xiàn)，ｅｌＫ的許多亞基如ｅＩＦ３ａ、ｅＩＦ３ｂ、ｅＩＦ３ｅ、ｅＩＦ３ｆ、ｅＩＦ３ｈｅＩＦ３ｉ在腫瘤中均有異常表達，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)［１８］。組成ｅＩＦ３個亞基既可以從完整的ｅＩＦ３復合物的角度在蛋白質(zhì)合成調(diào)控中發(fā)揮作用［１９］，逡逑而對腫瘤的發(fā)生發(fā)展產(chǎn)生影響［２０］，也能單獨地通過其他方式發(fā)揮各亞基其面的作用而調(diào)控基因的表達［２１］。因此，研宄ｅＩＦ３復合物中各個亞基在腫瘤發(fā)展過程中的功能以及作用發(fā)揮的分子機制至關(guān)重要，可以為腫瘤的診斷治以及預后提供依據(jù)。逡逑

山東大學碩士學位論文通過激活Ｐ－ｃａｔｅｎｉｎ信號通路促進癌癥的進，ｅＩＦ３ｂ被推測可作為腎癌的診斷標志物結(jié)構(gòu)及功能有一定的了解，但ｅＩＦ３ｂ是否在因此，本實驗將從研宄ｅＩＦ３ｂ在胃癌細胞增探討ｅＩＦ３ｂ在胃癌發(fā)生發(fā)展過程中的作用。逡逑ＲＮＡ－ｂｉｎｄｉｎｇ逡逑ｓｕｕｎｉｔｓ逡逑

山東大學碩士學位論文實驗結(jié)果逡逑系中ｅ邋Ｉ邋Ｆ３ｂ的表達及特異性ｓ邋ｉ邋ＲＮＡ干擾效率的檢測逡逑Ｒ檢測胃上皮細胞永生化細胞ＧＥＳ－１和ＡＧＳ、ＳＧＣ７９０１、ＭＧＣ２７五種不同胃癌細胞中ｅＩＦ３ｂ邋ｍＲＮＡ的表達水平，結(jié)的胃癌細胞ＳＧＣ７９０１和ＭＧＣ８０３中ｅＩＦ３ｂ邋ｍＲＮＡ表達＊＊＊ｐ＜０．００１），具有統(tǒng)計學意義。因此我們選擇用ＳＧＣ７后續(xù)細胞功能實驗的研宄對象。逡逑１５－１逡逑

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 Shiu-Wan Chan;;Establishment of chronic hepatitis C virus infection:Translational evasion of oxidative defence[J];World Journal of Gastroenterology;2014年11期

2 Ko Eun Lee;Pham Ngoc Khoi;Yong Xia;Jung Sun Park;Young Eun Joo;Kyung Keun Kim;Seok Yong Choi;Young Do Jung;;Helicobacter pylori and interleukin-8 in gastric cancer[J];World Journal of Gastroenterology;2013年45期

本文編號：2765206