發(fā)布時(shí)間：2020-07-22 02:46

【摘要】：研究背景胃癌是一種源自胃黏膜上皮的惡性腫瘤,近年來(lái),胃癌發(fā)病率在全球范圍內(nèi)有所下降,但在中國(guó)胃癌的發(fā)病率和死亡率均高居第二位,對(duì)人類健康依然有嚴(yán)重的威脅。胃癌的發(fā)生發(fā)展是一個(gè)復(fù)雜的、多因素參與的過(guò)程,基因表達(dá)調(diào)控的異常在胃癌的發(fā)生中發(fā)揮關(guān)鍵作用。對(duì)基因最主要的調(diào)控發(fā)生在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平,最終表達(dá)的蛋白產(chǎn)物可直接或間接地作用于調(diào)控細(xì)胞增殖、凋亡、遷移等重要生物學(xué)功能的信號(hào)通路而發(fā)揮作用。目前,蛋白翻譯水平的調(diào)控,尤其是對(duì)翻譯起始步驟的研究,已經(jīng)證明真核翻譯起始因子eIFs(eukaryotic initiation factors)能通過(guò)對(duì)蛋白翻譯和細(xì)胞周期的調(diào)控,在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮關(guān)鍵性的作用。真核翻譯起始因子eIF3是eIFs中最復(fù)雜,也是最重要的一個(gè)多亞基復(fù)合物,目前已確定包含的亞單位有13個(gè)(eIF-3a,-3b,-3c...-3m)。eIF3通過(guò)與其它翻譯起始因子的相互作用促使43S核糖體復(fù)合物前體的形成,進(jìn)而結(jié)合mRNA,識(shí)別起始密碼子AUG,在翻譯起始過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。這一功能主要借助于eIF3的核心亞基eIF3a、eIF3b、eIF3e、eIF3f、eIF3h以及eIF3i,研究發(fā)現(xiàn),這6個(gè)亞基在眾多腫瘤中均有異常表達(dá),與腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)。eIF3b由于其結(jié)構(gòu)的特殊性,在eIF3復(fù)合物中起著腳手架功能,人類eIF3b帶有RNA識(shí)別序列(RRM),位于蛋白質(zhì)N端,RRM結(jié)構(gòu)域可以提供一個(gè)特定位點(diǎn),使eIF3b與eIF3J等其它亞基相互作用。目前,大量研究提示eIF3b通過(guò)對(duì)蛋白翻譯的調(diào)控參與細(xì)胞周期、凋亡、細(xì)胞侵襲和遷移等癌癥相關(guān)信號(hào)通路,影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展。eIF3b已被證明在前列腺癌和膀胱癌中過(guò)表達(dá),以及它的過(guò)度表達(dá)與癌癥預(yù)后有關(guān);eIF3b沉默表達(dá)能抑制結(jié)腸癌細(xì)胞和成膠質(zhì)細(xì)胞瘤細(xì)胞的增殖;eIF3b在骨肉瘤、食管鱗狀細(xì)胞癌和腎細(xì)胞癌中均異常表達(dá),對(duì)癌細(xì)胞的侵襲和遷移起到了推動(dòng)作用。然而,eIF3b在胃癌中的表達(dá)情況及其在胃癌的發(fā)生發(fā)展中是否發(fā)揮作用目前尚無(wú)報(bào)道。因此,本實(shí)驗(yàn)研究了 eIF3b在胃癌中的表達(dá)情況及其在胃癌發(fā)生發(fā)展中的作用。實(shí)驗(yàn)?zāi)康难芯縠IF3b在胃癌細(xì)胞和組織中的表達(dá)情況及其對(duì)胃癌細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移的作用及機(jī)制,探討eIF3b作為胃癌診斷標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)的潛在價(jià)值。1.eIF3b對(duì)胃癌細(xì)胞增殖、侵襲和遷移的影響QRT-PCR檢測(cè)不同的胃癌細(xì)胞系(SGC7901、BGC823、MGC803、AGS和HGC27)中eIF3b mRNA的表達(dá)水平。利用eIF3b的小干擾RNA轉(zhuǎn)染至eIF3b mRNA表達(dá)水平較高的兩個(gè)細(xì)胞系SGC7901和MGC803中,用QRT-PCR和Western blot檢測(cè)其對(duì)eIF3b基因表達(dá)的干擾效果,通過(guò)克隆形成實(shí)驗(yàn)和CCK8細(xì)胞活力實(shí)驗(yàn)檢測(cè)下調(diào)eIF3b對(duì)胃癌細(xì)胞增殖能力的影響;通過(guò)Transwell遷移實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)下調(diào)eIF3b對(duì)胃癌細(xì)胞遷移能力的影響;通過(guò)Transwell基質(zhì)膠侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)下調(diào)eIF3b對(duì)胃癌細(xì)胞侵襲能力的影響。2.動(dòng)物實(shí)驗(yàn)檢測(cè)eIF3b在體內(nèi)對(duì)胃癌細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移的影響利用慢病毒(Lentivirus)包被的eIF3b的干擾載體處理胃癌細(xì)胞SGC7901,可有效將外源基因整合到宿主染色體上,從而持久性的下調(diào)eIF3b的表達(dá),QRT-PCR 檢測(cè)干擾效率,將 Lentivirus-negative control 和 Lentivirus-eIF3b 感染成功的SGC7901細(xì)胞分別接種到裸鼠皮下和尾靜脈,觀察裸鼠皮下成瘤和腫瘤肺部轉(zhuǎn)移情況,觀察在體內(nèi)下調(diào)eIF3b對(duì)胃癌細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移的影響。3.eIF3b調(diào)控胃癌相關(guān)信號(hào)通路中重要基因的表達(dá)慢病毒包被的eIF3b的干擾載體感染胃癌細(xì)胞SGC7901和MGC803,Western blot和ELISA檢測(cè)能影響胃癌細(xì)胞增殖、侵襲和遷移相關(guān)的信號(hào)通路中重要基因的表達(dá)情況,包括 p27、E2F1、AKT、IL-8、Vimentin、CyclinD、CyclinE 和β-catenin等。根據(jù)檢測(cè)結(jié)果,選擇下調(diào)比較明顯的E2FI分子進(jìn)行后續(xù)的拯救實(shí)驗(yàn),將高表達(dá)的E2F1質(zhì)粒和eIF3b的特異性小干擾共轉(zhuǎn)染到SGC7901和MGC803細(xì)胞中,設(shè)置 si-NC + pcDNA-NC、si-eIF3b + pcDNA-NC、si-eIF3b + pcDNA-E2F13組分別進(jìn)行克隆形成和Transwell實(shí)驗(yàn),驗(yàn)證下調(diào)eIF3b的表達(dá)能夠直接或間接地調(diào)控胃癌相關(guān)信號(hào)通路中重要基因的表達(dá)從而影響胃癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移。4.eIF3b在人慢性胃炎和胃癌組織標(biāo)本中的表達(dá)QRT-PCR檢測(cè)39例人慢性胃炎和正常胃粘膜組織標(biāo)本以及46對(duì)胃癌和遠(yuǎn)端癌旁組織標(biāo)本中eIF3b的mRNA表達(dá)水平,免疫組化檢測(cè)胃癌組織切片中eIF3b的蛋白表達(dá)水平,分析eIF3b的表達(dá)水平與胃癌患者相關(guān)病理參數(shù)的相關(guān)性,評(píng)估其是否能作為胃癌的潛在診斷標(biāo)志物。5.幽門螺桿菌感染對(duì)胃癌細(xì)胞中eIF3b表達(dá)的影響幽門螺桿菌Hp11637和Hp26695,按照MOI 1:100,感染胃癌細(xì)胞AGS,對(duì)照組加PBS,分別在幽門螺桿菌感染細(xì)胞后6h、12h和24h收取細(xì)胞,QRT-PCR檢測(cè)各組中eIF3bmRNA表達(dá)水平;再用Hp11637和Hp26695,按照MOI 1:50、1:100和1:150分別感染AGS細(xì)胞,12h后收取細(xì)胞,QRT-PCR和Western blot分別檢測(cè)各組中eIF3b的mRNA和蛋白表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)結(jié)果1.下調(diào)eIF3b的表達(dá)抑制胃癌細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移QRT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示,eIF3b mRNA表達(dá)水平在胃癌細(xì)胞系SGC7901和MGC803中明顯高于其它幾種胃癌細(xì)胞系;用eIF3b特異性siRNA轉(zhuǎn)染胃癌細(xì)胞SGC7901和MGC803,與轉(zhuǎn)染的對(duì)照組(siRNA-negative control)相比,實(shí)驗(yàn)組中eIF3b mRNA和蛋白水平均明顯下降。克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,下調(diào)eIF3b的表達(dá)顯著抑制胃癌細(xì)胞SGC7901和MGC803的克隆形成能力;CCK8細(xì)胞活力實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,下調(diào)eIF3b顯著抑制SGC7901和MGC803的增殖能力;Transwell基質(zhì)膠侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,下調(diào)eIF3b的表達(dá)顯著抑制胃癌細(xì)胞SGC7901和MGC803的侵襲能力;Transwell遷移實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,下調(diào)eIF3b的表達(dá)顯著抑制胃癌細(xì)胞SGC7901和MGC803的遷移能力。2.下調(diào)eIF3b的表達(dá)在體內(nèi)抑制了胃癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移QRT-PCR 和 Western blot 檢測(cè) Lentivirus-eIF3b 可有效下調(diào) SGC7901 細(xì)胞中eIF3b mRNA的表達(dá)水平。皮下注射胃癌細(xì)胞的裸鼠,5天后,對(duì)照組觀察到較為明顯的微小瘤體,9天后,開始測(cè)量瘤體大小,19天后處死裸鼠,瘤體的實(shí)體觀察和生長(zhǎng)曲線表明,與對(duì)照組相比,下調(diào)eIF3b的表達(dá)能抑制裸鼠體內(nèi)瘤體的增殖。尾靜脈注射胃癌細(xì)胞的裸鼠,兩個(gè)月后處死,取出肺組織,經(jīng)動(dòng)物活體成像儀拍攝顯示,對(duì)照組比實(shí)驗(yàn)組有更嚴(yán)重的肺部轉(zhuǎn)移現(xiàn)象。肺組織實(shí)體觀察和稱重顯示,對(duì)照組腫瘤結(jié)節(jié)數(shù)目多、體積大,肺的重量明顯大于干擾組。肺部瘤體切片HE染色結(jié)果顯示,在裸鼠肺部對(duì)照組比實(shí)驗(yàn)組癌細(xì)胞浸潤(rùn)明顯。3.下調(diào)eIF3b的表達(dá)影響胃癌相關(guān)信號(hào)通路中重要基因的表達(dá)Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示,下調(diào)eIF3b的表達(dá),在SGC7901和MGC803細(xì)胞中抑制了與胃癌細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移相關(guān)的基因E2F1、CyclinD、CyclinE、Vimentin和β-catenin的蛋白表達(dá)水平,升高了抑癌基因p27的蛋白表達(dá)水平。ELISA結(jié)果顯示,下調(diào)eIF3b的表達(dá),抑制了 SGC7901細(xì)胞中IL-8的蛋白表達(dá)水平,升高了 MGC803細(xì)胞中IL-8的蛋白表達(dá)水平。表明下調(diào)eIF3b的表達(dá)可能通過(guò)對(duì)p27、E2F1、CyclinD、CyclinE、Vimentin、β-catenin 和 IL-8 的調(diào)控從而影響胃癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移。拯救實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,下調(diào)eIF3b的表達(dá)對(duì)SGC7901和MGC803細(xì)胞增殖和遷移的抑制作用部分依賴于E2F1。4.eIF3b在人慢性胃炎和胃癌組織標(biāo)本中高表達(dá)QRT-PCR結(jié)果顯示eIF3b mRNA在人慢性胃炎組織中的表達(dá)水平比在正常胃黏膜組織中的表達(dá)水平高,而且在Hp陽(yáng)性(Hp+)胃炎組織中的表達(dá)水平比在Hp陰性(Hp-)胃炎組織中的表達(dá)水平高。QRT-PCR結(jié)果顯示eIF3bmRNA在胃癌組織中的表達(dá)水平比在正常胃組織中的表達(dá)水平高,而且表達(dá)水平與胃癌患者的臨床病理分期相關(guān)。免疫組化結(jié)果顯示與癌旁正常組織相比,胃癌組織中eIF3b蛋白表達(dá)水平明顯增高,而且eIF3b主要在細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)。5.幽門螺桿菌Hp11637和Hp26695能夠上調(diào)胃癌細(xì)胞中eIF3b的表達(dá)水平QRT-PCR結(jié)果顯示,Hp11637和Hp26695以MOI1:100感染胃癌細(xì)胞AGS,感染12h后AGS細(xì)胞中eIF3b的mRNA表達(dá)水平明顯升高;幽門螺桿菌毒力因子CagA可明顯上調(diào)AGS細(xì)胞中eIF3b的表達(dá)。Hp11637和Hp26695分別以MOI 1:50、1:100和1:150感染胃癌細(xì)胞AGS,感染12h后細(xì)胞中eIF3b的mRNA和蛋白表達(dá)水平逐漸上調(diào)。實(shí)驗(yàn)結(jié)論1.eIF3b能夠通過(guò)調(diào)控腫瘤相關(guān)通路中的重要分子在體外促進(jìn)胃癌細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移。2.eIF3b在動(dòng)物體內(nèi)可以促進(jìn)胃癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移。3.eIF3b在人慢性胃炎和胃癌組織中表達(dá)升高,且與胃癌的分期相關(guān),提示eIF3b可能作為一種新的胃癌診斷標(biāo)志物。4.幽門螺桿菌感染可上調(diào)胃癌細(xì)胞中eIF3b的表達(dá),提示eIF3b可能參與幽門螺桿菌的致癌過(guò)程。
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R735.2
【圖文】：

山東大學(xué)碩士學(xué)位論文的相對(duì)分子質(zhì)量為５５０－７００ＫＤａ，目前己確定的亞單位有１３（ｅＩＦ３ａ，ｅＩＦ３ｂ．．．ｅＩＦ３ｍ）邋［１５］。在真核細(xì)胞蛋白質(zhì)翻譯起始過(guò)程中，ｅＩＦ３結(jié)合０Ｓ核糖體亞基上，通過(guò)與ｅＩＦ４等其它亞基之間的相互作用促使４３Ｓ核糖體合物前體的形成［１６］；邋ｅＩＦ３還參與對(duì)重起始的掃描以及對(duì)起始密碼子ＡＵＧ的別過(guò)程［１７］。研究發(fā)現(xiàn)，ｅｌＫ的許多亞基如ｅＩＦ３ａ、ｅＩＦ３ｂ、ｅＩＦ３ｅ、ｅＩＦ３ｆ、ｅＩＦ３ｈｅＩＦ３ｉ在腫瘤中均有異常表達(dá)，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)［１８］。組成ｅＩＦ３個(gè)亞基既可以從完整的ｅＩＦ３復(fù)合物的角度在蛋白質(zhì)合成調(diào)控中發(fā)揮作用［１９］，逡逑而對(duì)腫瘤的發(fā)生發(fā)展產(chǎn)生影響［２０］，也能單獨(dú)地通過(guò)其他方式發(fā)揮各亞基其面的作用而調(diào)控基因的表達(dá)［２１］。因此，研宄ｅＩＦ３復(fù)合物中各個(gè)亞基在腫瘤發(fā)展過(guò)程中的功能以及作用發(fā)揮的分子機(jī)制至關(guān)重要，可以為腫瘤的診斷治以及預(yù)后提供依據(jù)。逡逑

山東大學(xué)碩士學(xué)位論文通過(guò)激活Ｐ－ｃａｔｅｎｉｎ信號(hào)通路促進(jìn)癌癥的進(jìn)，ｅＩＦ３ｂ被推測(cè)可作為腎癌的診斷標(biāo)志物結(jié)構(gòu)及功能有一定的了解，但ｅＩＦ３ｂ是否在因此，本實(shí)驗(yàn)將從研宄ｅＩＦ３ｂ在胃癌細(xì)胞增探討ｅＩＦ３ｂ在胃癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的作用。逡逑ＲＮＡ－ｂｉｎｄｉｎｇ逡逑ｓｕｕｎｉｔｓ逡逑

山東大學(xué)碩士學(xué)位論文實(shí)驗(yàn)結(jié)果逡逑系中ｅ邋Ｉ邋Ｆ３ｂ的表達(dá)及特異性ｓ邋ｉ邋ＲＮＡ干擾效率的檢測(cè)逡逑Ｒ檢測(cè)胃上皮細(xì)胞永生化細(xì)胞ＧＥＳ－１和ＡＧＳ、ＳＧＣ７９０１、ＭＧＣ２７五種不同胃癌細(xì)胞中ｅＩＦ３ｂ邋ｍＲＮＡ的表達(dá)水平，結(jié)的胃癌細(xì)胞ＳＧＣ７９０１和ＭＧＣ８０３中ｅＩＦ３ｂ邋ｍＲＮＡ表達(dá)＊＊＊ｐ＜０．００１），具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。因此我們選擇用ＳＧＣ７后續(xù)細(xì)胞功能實(shí)驗(yàn)的研宄對(duì)象。逡逑１５－１逡逑

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 Shiu-Wan Chan;;Establishment of chronic hepatitis C virus infection:Translational evasion of oxidative defence[J];World Journal of Gastroenterology;2014年11期

2 Ko Eun Lee;Pham Ngoc Khoi;Yong Xia;Jung Sun Park;Young Eun Joo;Kyung Keun Kim;Seok Yong Choi;Young Do Jung;;Helicobacter pylori and interleukin-8 in gastric cancer[J];World Journal of Gastroenterology;2013年45期

本文編號(hào)：2765206