發(fā)布時間：2020-07-22 05:05

【摘要】：研究背景:腸癌是目前導(dǎo)致人類死亡的第三大惡性疾病,在由癌癥引起的死亡原因中排第二位。盡管最近研發(fā)了幾種新的腸癌病人的治療方法,但是對于腸癌晚期病人的臨床療效仍不甚理想,腫瘤轉(zhuǎn)移仍是腸癌病人死亡的最重要原因。盡管我們在腸癌的治療方法上取得了巨大成功,但腸癌的總體死亡率仍接近40%。手術(shù)是最基本的治療手段,然而仍有30%到50%的Ⅰ到Ⅲ期的腫瘤病人會在后續(xù)五年的治療中復(fù)發(fā)。此外,由于內(nèi)源性或外源性導(dǎo)致的耐藥性的產(chǎn)生,奧沙利鉑或5-氟尿嘧啶這樣最常見的抗癌藥已經(jīng)不能對結(jié)腸癌發(fā)揮有效作用,甚至對其產(chǎn)生了藥物抵抗。目前研究認(rèn)為,Wnt/β-catenin信號通路的異常激活是導(dǎo)致腸癌腫瘤形成和預(yù)后至關(guān)重要的因素之一。研究證實Wnt/β-catenin信號通路在細(xì)胞分化和增殖、器官形成、胚胎發(fā)育、及腫瘤發(fā)生中都發(fā)揮重要作用。β-catenin是Wnt信號通路的關(guān)鍵分子,Wnt/β-catenin信號通路的特點是β-catenin的積聚和核定位。胞漿內(nèi)的 β-catenin 受腺瘤病蛋白(adenomatosis polyposis coli,APC)、軸蛋白(Axin)、蛋白磷酸酶 2A(protein phosphatase 2A,PP2A)、糖原合酶激酶 3β(glycogen synthase kinase 3 beta,GSK3β)和酪蛋白激酶 1α(casein kinase 1α,CK1α)組成的降解蛋白復(fù)合物的調(diào)控。當(dāng)Wnt信號通路被激活時,β-catenin從降解復(fù)合物中釋放出來并轉(zhuǎn)移到核內(nèi),與T細(xì)胞因子/淋巴增強(qiáng)因子轉(zhuǎn)錄因子(T-cell factor/lymphoid enhancer factor,TCF/LEF)家族一起激活特定的下游 Wnt靶基因如c-myc、cyclinDl和COX等。Wnt信號異常的腫瘤都存在β-catenin表達(dá)水平上調(diào),因此靶向β-catenin的治療越來越引起廣泛關(guān)注。分化抑制因子(inhibitor of differentiation,Id),屬于螺旋-環(huán)-螺旋(helix-loop-helix,HLH)轉(zhuǎn)錄因子家族成員,對堿性 HLH(basic helix-loop-helix,bHLH)轉(zhuǎn)錄因子活性起負(fù)調(diào)節(jié)作用。Id分子是胚胎形成過程中的必要因子,它們在細(xì)胞增殖、分化和生長過程中發(fā)揮重要的功能。目前共發(fā)現(xiàn)4種Id分子,即Id1、Id2、Id3和Id4。Id3蛋白屬于四種同源蛋白家族之一,近年來的研究表明,Id3在腫瘤細(xì)胞生長、分化、凋亡、侵襲、轉(zhuǎn)移和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等方面都發(fā)揮重要的調(diào)控作用。本實驗室前期研究發(fā)現(xiàn),Id3 mRNA及蛋白在人肺腺癌細(xì)胞株(A549)細(xì)胞和A549細(xì)胞耐藥株(A549/DDP)細(xì)胞中均呈低水平的表達(dá),過表達(dá)Id3可抑制A549和A549/DDP細(xì)胞的增殖、促進(jìn)其凋亡。此外還發(fā)現(xiàn)Id3還可逆轉(zhuǎn)A549/DDP對順鉑的耐藥性。最近有研究發(fā)現(xiàn),Id3可以通過調(diào)節(jié)β-catenin的mRNA和蛋白的水平來促進(jìn)角質(zhì)細(xì)胞凋亡、影響角質(zhì)細(xì)胞增殖,然而關(guān)于Id3對腸癌細(xì)胞中β-catenin的表達(dá)調(diào)控機(jī)制尚未見研究報道。本研究按以下三部分進(jìn)行:第一部分:Id3及β-catenin mRNA在不同腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)分析目的:主要研究Id3與β-catenin mRNA在不同腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)水平方法:采用Trizol法提取各腫瘤細(xì)胞系總RNA,運(yùn)用實時熒光定量PCR(qRT-PCR)技術(shù)分析腫瘤細(xì)胞中Id3和β-catenin mRNA的相對表達(dá)量。結(jié)果:Id3 mRNA在不同惡性腫瘤細(xì)胞系中有不同程度的表達(dá),在腸癌細(xì)胞株SW-480及HT-29中表達(dá)量最低;而β-catenin在SW-480細(xì)胞中的表達(dá)水平顯著高于其他惡性腫瘤細(xì)胞。結(jié)論:Id3和β-catenin在不同的腫瘤細(xì)胞中有不同的表達(dá)水平;β-catenin在腸癌細(xì)胞中的異常高表達(dá)可能是引起腸癌的重要因素之一。第二部分:Id3過表達(dá)對腫瘤細(xì)胞中β-catenin表達(dá)水平的影響目的:本文主要研究Id3基因過表達(dá)對三種腫瘤細(xì)胞中β-catenin表達(dá)的影響。方法:采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染技術(shù)將含人Id3基因的真核表達(dá)載體Id3/pEGFP分別導(dǎo)入腸癌細(xì)胞(SW-480)、人肺腺癌細(xì)胞(A549)和人肺腺癌細(xì)胞耐順鉑株(A549/DDP)三種細(xì)胞,熒光顯微鏡觀察細(xì)胞內(nèi)Id3-EGFP融合蛋白的表達(dá)情況;qRT-PCR技術(shù)分析轉(zhuǎn)染后細(xì)胞內(nèi)Id3及β-catenin的mRNA表達(dá)水平;Western blot分析轉(zhuǎn)染后細(xì)胞內(nèi)Id3及β-catenin蛋白的表達(dá)水平。結(jié)果:在Id3過表達(dá)的腸癌細(xì)胞SW-480中,β-catenin表達(dá)水平明顯下調(diào),與空載體對照組比較表達(dá)水平有顯著性差異(p0.01);而在A549和A549/DDP細(xì)胞中,Id3過表達(dá)對β-catenin的表達(dá)水平與空載體對照組比較均無顯著差異(p0.01)。結(jié)論:外源性轉(zhuǎn)染Id3基因可明顯下調(diào)腸癌SW-480細(xì)胞中β-catenin的表達(dá),有望為腸癌靶基因治療提供新思路。第三部分:Id3過表達(dá)對腸癌SW-480細(xì)胞增殖、凋亡、及遷移的影響目的:Id3是在多種腫瘤細(xì)胞中影響細(xì)胞的增殖、遷移及調(diào)節(jié)細(xì)胞的周期進(jìn)程。本研究主要探討Id3基因過表達(dá)對腸癌SW-480細(xì)胞生物學(xué)活性的影響。方法:分別采用CCK-8法和流式細(xì)胞術(shù)檢測真核表達(dá)載體Id3/pEGFP轉(zhuǎn)染SW-480細(xì)胞后的細(xì)胞增殖和凋亡情況;采用全息成像技術(shù)檢測細(xì)胞遷移功能。結(jié)果:外源性Id3表達(dá)除可明顯抑制腸癌細(xì)胞的增殖、促進(jìn)其凋亡外,還可抑制SW-480細(xì)胞的遷移,提示Id3可能是一種腸癌負(fù)調(diào)控因子。結(jié)論:以上結(jié)果表明Id3可能在腸癌發(fā)生發(fā)展中可能發(fā)揮腫瘤抑制基因的作用。
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R735.3
【圖文】：

４．１邐Ｉｄ３過表達(dá)抑制ＳＷ－４８０細(xì)胞的增殖。ＳＷ－４８０細(xì)胞分成ｐＥＧＦＰ／Ｉｄ３過表達(dá)組、逡逑ｐＥＧＦＰ空載體組及空白細(xì)胞對照組三組。ＣＣＫ－８法檢測細(xì)胞增殖結(jié)果顯示，ｐ逡逑Ｉｄ３／ＥＧＦＰ過表達(dá)可明顯抑制ＳＷ－４８０細(xì)胞增殖（Ｐ＜０．０５；圖３－丨），表明Ｉｄ３在逡逑ＳＷ－４８０細(xì)胞中發(fā)揮腫瘤抑制功能。逡逑２．２逡逑２邋０邐Ｃｏｎｔｒｏｌ逡逑４邋ａ邋．邐－0－邋ｐＥＧＦＰ／ｋｔｔ邐Ａ逡逑ｒｙ逡逑０．０邋邐邐邐邐邐．邐．邐逡逑Ｏｄａｙ邐１ｄａｙ邐２ｄａｙ邐３ｄａｙ逡逑圖３－ｌ過表達(dá)Ｉｄ３抑制ＳＷ－４８０細(xì)胞增殖逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋３－１邋Ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ邋ｏｆＩｄ３邋ｓｕｐｐｒｅｓｓｅｓ邋ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ邋ｉｎ邋ＳＷ－４８０邋ｃｅＩｌｓ．＊＿Ｐ＜０．０５．逡逑４．２邐Ｉｄ３過表達(dá)促進(jìn)ＳＷ－４８０細(xì)胞凋亡。流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果表明，與空載體轉(zhuǎn)染組相逡逑比，Ｉｄ３過表達(dá)組ＳＷ－４８０細(xì)胞凋亡率明顯增高（圖３－２）。逡逑Ａ邐Ｂ逡逑ＴＴ邐了逡逑邐邐邋°１逡逑ｔｉｌ—邋ｔｉｌ：；邋＾逡逑ｐＥＧＦＰ邐ｋＪ３／ＤＥＧＦＰ逡逑Ｃ逡逑２０邋－逡逑ｐＥＧＦＰ邐Ｉｄ３／ｐＥＧＦＰ逡逑３１逡逑

逡逑圖３－２邋ｌｄ３誘導(dǎo)ＳＷ－４８０細(xì)胞凋亡逡逑Ａ：邋ｐＥＧＦＰ轉(zhuǎn)染組Ｂ：邋ｐＥＧＦＰ／Ｉｄ３轉(zhuǎn)染組Ｃ：直方圖顯示細(xì)胞凋亡比例逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋３－２邋Ｉｄ３邋ｉｎｄｕｃｅｄ邋ａｐｏｐｔｏｓｉｓ邋ｏｆ邋ＳＷ－４８０邋ｃｅｌｌｓ逡逑Ａ：邋ｐＥＧＦＰ－邋ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ邋ｇｒｏｕｐ邋Ｂ：邋ｐＥＧＦＰ／Ｉｄ３－邋ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ邋ｇｒｏｕｐ逡逑Ｃ：邋Ｔｈｅ邋ｐｅｒｃｅｎｔａｇｅｓ邋ｏｆ邋ａｐｏｐｔｏｔｉｃ邋ｃｅｌｌｓ邋ａｒｅ邋ｓｈｏｗｎ邋ｗｉｔｈ邋ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｖｅ邋ｈｉｓｔｏｇｒａｍｓ．邋＊Ｐ＜０．０５．逡逑４．３邋１ｄ３過表達(dá)抑制ＳＷ－４８０細(xì)胞遷移。全息成像數(shù)據(jù)顯示（圖３－３Ａ），邋２４ｈ－３０ｈ的逡逑ｐＥＧＦＰ／ｌｄ３過表達(dá)組腫瘤細(xì)胞的遷移速度和距離明顯小于空載體組和空白細(xì)逡逑胞組細(xì)胞（圖３－３）。這些結(jié)果顯示丨ｄ３過表達(dá)可降低ＳＷ－４８０細(xì)胞的遷移能力。逡逑Ａ逡逑ＷＢ逡逑Ｂ邐Ｃ逡逑丨ｉ邋NB逡逑Ｏｈ邋６ｈ邋１２ｈ邐１８ｈ邐２４ｈ邐３０ｈ邐0邋邐＾邐邐，邐，邐，邐，邐逡逑Ｏｈ邋６ｈ邋１２ｈ邐１８ｈ邐２４ｈ邐３０ｈ逡逑圖３－３邋Ｉｄ３抑制ＳＷ－４８０細(xì)胞遷移逡逑Ａ：全息成像圖Ｂ：細(xì)胞遷移速度Ｃ：細(xì)胞遷移距離逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋３－３邋Ｉｄ３邋ｓｕｐｐｒｅｓｓｅｓ邋ｍｉｇｒａｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ＳＷ－４８０邋ｃｅｌｌｓ逡逑Ａ：邋ｄｉｇｉｔａｌ邋ｈｏｌｏｇｒａｐｈｉｃ邋ｉｍａｇｉｎｇ邋Ｂ：邋ｃｅｌｌ邋ｍｏｔｉｌｉｔｙ邋ｓｐｅｅｄ邋Ｃ：邋ｃｅｌｌ邋ｍｏｔｉｌｉｔｙ邋ｄｉｓｔａｎｃｅ．邋＊尸＜０．０５．逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋３－４邋Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ｐ－ｃａｔｅｎｉｎ邋ｂ

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前5條

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本文編號：2765365