本文關(guān)鍵詞：微流控芯片技術(shù)在循環(huán)腫瘤細胞分離中的研究進展，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

生物化學(xué)與生物物理進展

ProgressinBiochemistryandBiophysics2015,42(4):301~312

微流控芯片技術(shù)在循環(huán)腫瘤細胞

分離中的研究進展*

呂曉慶1)李

雷2)**陳紅梅3)陳鵬4)**劉靜2)

移的必要前提[1-2]．微環(huán)境改變的條件下，CTCs又發(fā)生間質(zhì)-上皮轉(zhuǎn)化(mesenchymal-epithelialtransition，MET)而在遠端器官中停留，生成新的腫瘤，從而導(dǎo)致腫瘤轉(zhuǎn)移[3]．CTCs檢測在新的腫瘤生物標志物的發(fā)現(xiàn)、腫瘤預(yù)后判斷及個體化治療方面存在很大的應(yīng)用潛力，是國內(nèi)外腫瘤研究的熱點之一．然而，CTCs在血液中的數(shù)量非常少，109個血細胞中僅含有1～10個CTCs[4]，因此，CTCs研究的關(guān)鍵在于從含有大量血細胞的復(fù)雜血液樣本中準確、高效地將其分選出來[5]，滿足高捕獲率、高純度和高通量的要求，進而成為能夠滿足科研和臨床需求的工具．a(chǎn)．高捕獲率，即可以將樣品中的CTCs盡可能多地分離出來；b．高純度，

它是一個依賴于免疫磁珠原理的半自動化工作系統(tǒng)．該系統(tǒng)通過連接了抗上皮細胞黏附分子抗體(epithelialcelladhesionmolecule，EpCAM)的磁珠和CTCs表面標志物EpCAM特異性結(jié)合，達到捕獲CTCs的目的．CTCs的識別使用經(jīng)典的免疫染色法．該系統(tǒng)分選CTCs效率為80%[6]．盡管

*中國科學(xué)院重點部署項目(KJZD-EW-TZ-L03-6)，天津市自然科學(xué)基金項目(13JCYBJC23600)，國家自然科學(xué)基金面上項目(61078074)和中國博士后科學(xué)基金(2014M550794)資助.**通訊聯(lián)系人.

李雷.Tel:010-82543766,E-mail:lileilei@mail.ipc.ac.cn陳鵬.Tel:022-23340123,E-mail:chenpengdoc@sina.com收稿日期：2015-02-02，接受日期：2015-03-05

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CellSearch已通過FDA批準，但該系統(tǒng)還存在一些缺點，比如暫未實現(xiàn)全自動分選、假陽性比率高[7]、富集后的CTCs沒有生物活性等，更重要的是，CellSearch捕獲到的CTCs僅僅是EpCAM陽性的類型，而許多惡性程度很高的CTCs并不表達EpCAM，從而無法被檢測出來．

微流控芯片是一個集樣品制備、反應(yīng)、分離、檢測等功能于一體的小型分析實驗平臺，它通過微加工技術(shù)，在硅、玻璃、聚二甲基硅氧烷

需求，制作出進行實驗．將工作簡化到試劑的消耗靈敏度和分析隨斷擴展，分析為一測[10-11]、細胞顯示出巨大的應(yīng)用潛力．由于微流控芯片管道尺寸在微米量級和細胞尺寸匹配，非常適合應(yīng)用于細胞分選，近些年來，有越來越多的研究者將該技術(shù)應(yīng)用在CTCs的分選上．

微流控芯片分選和富集CTCs的原理主要分為4類：a．利用抗原抗體親和性進行分選；b．利用細胞物理特征的不同進行分選，比如細胞大小、變形性以及不同大小的細胞在流場中的力學(xué)特性；c．利用免疫磁珠具有磁性兼連接抗體的作用進行差異進行分選總結(jié)了近年的研究現(xiàn)狀和原理進行細胞方法之一道或微結(jié)構(gòu)特異性抗體

(a)A

B(b)C

血液

E

間距不等的微柱

D

過濾

確定性側(cè)向位移

Fig.1TheschematicofvariousCTCscapturingmicrofluidicchips圖1

微流控芯片捕獲CTCs各類芯片結(jié)構(gòu)示意圖

(a)親和性分選法(A:親和性分選芯片原理示意圖;B:親和性分選芯片系統(tǒng)裝置及芯片內(nèi)部微柱顯微照片).(b)物理特征分選法(C:大小-變形性分選微柱捕獲示意圖;D:大小-變形性分選微孔捕獲示意圖;E:確定性側(cè)向位移芯片示意圖).(c)免疫磁珠分選法(F:免疫磁珠捕獲原理示意圖;G:磁珠和大小-變形性方法結(jié)合捕獲示意圖，細胞與磁珠結(jié)合后，尺寸增加，更有利于細胞被捕獲).(d)雙向電泳分選法示意圖.

2015;42(4)呂曉慶,等：微流控芯片技術(shù)在循環(huán)腫瘤細胞分離中的研究進展

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或適配體，比如上皮細胞黏附分子，當(dāng)樣品流經(jīng)微

通道時，目的細胞表面抗原與微通道或微結(jié)構(gòu)上的特異性抗體或適配體結(jié)合，細胞被固定在芯片內(nèi)，其他細胞隨緩沖液流出芯片；再用合適的方法，比如更換緩沖液，洗脫并收集目的細胞進行下游分析.

He等[14]設(shè)計了一種由TiO2納米顆粒制備的具有生物相容性納米薄膜，在玻璃基底中旋涂這種納米薄膜，再在薄膜上修飾EpCAM抗體，樣品通過芯片時，CTCs結(jié)合在納米薄膜上而留在芯片中．該研究將人結(jié)腸癌細胞HCT116混入健康人血液作為待測樣品，成功分離出HCT116細胞，其效率約為80%．這種由納米顆粒組成的納米薄膜可以增加抗體和細胞表面抗原之間的接觸機率．通過加大流體剪切力可將約50%的被捕獲細胞洗脫下來，洗脫下來的細胞具有生物活性，可進行體外培養(yǎng)．Sheng等[15]制作了幾何增強混合(geometricallyenhancedmixing)芯片，簡稱“GEMchip”，大小與載玻片相同，芯片中有很多魚脊形或形結(jié)構(gòu)，8個并聯(lián)管道用以加大通量．這內(nèi)部的魚脊形或V形結(jié)構(gòu)形成渦流高胞與抗體之間的接觸機率，有利于目的細胞與芯片結(jié)構(gòu)內(nèi)修飾的抗體結(jié)合，，從而高效捕獲CTCs．該研究將人胰腺癌細胞混入健康人血液作為待測樣品進行實驗，捕獲效率高達90%，同樣，被捕獲的腫瘤細胞可以被洗脫并繼續(xù)培養(yǎng)進行后續(xù)實驗．Launiere等[16]設(shè)計了一種內(nèi)部連接EpCAM和E選擇素(E-selectin)的雙抗體芯片，E選擇素用于加大腫瘤細胞在所受流體剪切力作用下的捕獲效率，與其結(jié)合的白細胞可以用一種螯合鈣的緩沖液洗脫下來，腫瘤細胞則留在芯片內(nèi)．文中還用只修飾EpCAM抗作為對比，證明這種方法的捕獲效率是抗體的芯片捕獲效率的1.9計了具有微柱陣列結(jié)構(gòu)系EpCAM表平系NCI-H165的懸液99%，對于116例腫瘤轉(zhuǎn)(包括胰腺癌、乳腺癌和結(jié)腸癌)到了數(shù)量不等的CTCs．其捕獲CTCs的微流控芯片整理列捕獲單元

TiO2納米顆粒納魚脊形或V形直線微柱PDMS魚骨曲線PMMA微管道金納米孔PMMA微管道納米多孔聚碳酸酯膜

硅納米柱子

-：文章中未提．

tocaptureCTCs

CTCs文獻總結(jié)

樣品

HCT116細胞混于血液L3.6pl細胞混于血液MCF-7細胞PBS懸液

NCI-H165細胞PBS懸液，癌癥病人血液

PC-3細胞混于血液15例轉(zhuǎn)移性前列腺癌病人血液

MCF-7細胞混于血液中PANC-1細胞混于血液PC-3細胞混于白細胞MCF-7、PC-3、T-26細胞混于血液

26例前列腺癌病人血液

捕獲效率/%

8090959991.897-7095

參考文獻[14][15][16][17][18][19][20][21][22]

表Anti-EpCAMAnti-EpCAMAnti-EpCAMAnti-EpCAM

親和性分選法有特異性高的優(yōu)點，能有效分選形狀、大小相似的不同種類細胞．目前大部分研究者采用EpCAM作為CTCs的表面特異性抗原[14-22]，但是在不同的腫瘤亞型中，EpCAM的表達各不相同，例如乳腺癌細胞系MCF-7和MDA-MB-231的EpCAM表達水平不同[23]，并且當(dāng)腫瘤細胞通過上

皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)作用傳播時，EpCAM和角蛋白(CKs)的表達下調(diào)，波形蛋白(vimentin)和N-鈣黏素(N-cardherin)表達上調(diào)[24]．依賴EpCAM的CTCs分選芯片會丟失不表達或低表達EpCAM的CTCs，然而這些CTCs具有更大的浸潤性和侵入性[25]．因此，缺乏公認的表面標志物限制了親和性分選在

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CTCs分選中的應(yīng)用．另外，親和性分選法要在通量和效率之間權(quán)衡，流速越大，CTCs和抗體反應(yīng)的時間越少，這會導(dǎo)致分選效率降低．親和性分選法與大小變形性分選法相結(jié)合，或使用多抗體修飾的芯片分選CTCs也許是個不錯的解決辦法，但不同種類抗體的反應(yīng)緩沖液以及反應(yīng)條件各不相同，實驗成本也會隨之增加．因此，增加芯片內(nèi)部結(jié)構(gòu)與細胞接觸的面積和機率，在芯片內(nèi)部修飾多種抗體捕獲不同蛋白質(zhì)表達的CTCs，是利用親和性分選法原理分離CTCs的微流控芯片發(fā)展的主要方向．另外這種方法非常適合分選已知表面抗原的目的細胞，比如血液中的一些免疫細胞等．

Hosokawa等[29]則用微腔陣列(microcavityarray，MCA)系統(tǒng)捕獲CTCs，該系統(tǒng)的核心結(jié)構(gòu)由100伊100個8～9滋m直徑的圓孔陣列組成，芯片下面連接蠕動泵．實驗中，NCI-H358細胞混在血液中，蠕動泵將樣品從蓄液池吸入芯片，血細胞通過圓孔隨緩沖液流出，腫瘤細胞則由于負壓作用被固定在圓孔上從而被成功分離．該系統(tǒng)可將混在1ml血液中的10個腫瘤細胞在15min內(nèi)完全捕獲，并且保持細胞活性．染色鑒別結(jié)果證明其分選效率高達97%，大大同一實驗樣本采用CellSearch系統(tǒng)的等[30]設(shè)計了一種不同間距的“棘齒”型微，間距依次從18滋m到2滋m樣品呈振蕩流，與垂直方向流速，腫瘤細胞和膀胱癌細胞摻在健康在70%以上．Lv等[31]設(shè)計種間距，該芯片結(jié)構(gòu)分為過兩過濾部分的作用是濾掉血液中大限度減少芯片堵塞；捕獲部分則設(shè)計微柱，間距從12滋m到4滋m遞減，血過微柱，而腫瘤細胞則被捕獲，腫瘤細胞酸鹽緩沖液(phosphatebufferedsaline，PBS)液樣品的捕獲效率高達90%以上．其他基于細胞大小和變形性差異原理捕獲循環(huán)腫瘤細胞的微流控芯片整理列于表2．

基于細胞大小和變形性差異分選法捕獲CTCs的優(yōu)勢在于：a．操作過程簡單，樣品只需用緩沖液稀釋，不需要進行染色標記，檢測時直接將稀釋后的全血通入芯片，在出口處收集細胞即可；b．捕獲效率高；c．能夠?qū)崿F(xiàn)高通量分選；d．成本遠遠低于CellSearch；e．無需依賴表面標志物，分選出的CTCs可以用多種抗體進行標志物鑒別．該方法存在的問題是僅僅基于細胞尺寸和變形性不同而進行過濾式分選，由于CTCs尺寸和白細胞有重疊部分，CTCs有可能會通過濾網(wǎng)或微柱的間隔，然而這些CTCs由于經(jīng)歷了EMT作用而具有間質(zhì)細胞特性，更容易發(fā)生轉(zhuǎn)移，惡性程度更高[32]；而且在較大的機械力作用下，CTCs隨著緩沖液流過微柱或者濾網(wǎng)時容易破裂[33]．這些因素會對分離純度和細胞活性造成一定影響，這類芯片在設(shè)計內(nèi)部捕獲單元時應(yīng)避免使用帶棱角的微柱，比如三角形、長方形、正方形等，而改用圓形、橢圓形等微柱，減少對細胞的損傷．

2物理特征分選

微流控芯片進行CTCs分選，常根據(jù)CTCs與血細胞物理特性(如變形性、大小、流體力學(xué)特性等)的差異，通過在芯片中設(shè)置不同的微結(jié)構(gòu)將其從血液中分離出來，常用的微結(jié)構(gòu)包括、微過濾網(wǎng)和微柱等．

2援1基于細胞大小和變形性差異

大多數(shù)上皮來源的CTCs直徑不等，而白細胞直徑從8～20滋．片內(nèi)部設(shè)計不同的小于徑、微網(wǎng)、微柱等結(jié)構(gòu)(圖1b(C品流經(jīng)芯片時，卡內(nèi)，血細胞則隨液流被結(jié)構(gòu)捕獲時，由于小，加大緩沖液流速時，被CTCs則留在芯片內(nèi)，從而達到分離Abnova公司的CXSystem[27]就是基于此原理分離CTCs的代，該系統(tǒng)還可以動態(tài)監(jiān)測CTCs的捕獲過程．芯片主要結(jié)構(gòu)由圓柱形微柱構(gòu)成，每個捕獲單元由三個圓柱排列組成一個“爪形”結(jié)構(gòu)．捕獲后的CTCs可以進行染色鑒別和計數(shù)，亦可被重新收集繼續(xù)培養(yǎng)進行后續(xù)實驗，如研究CTCs的分子生物學(xué)特征、建立動物模型、臨床個體病例研究等．

Lim等[28]設(shè)計了一種微篩芯片，該芯片由硅片加工而成，其捕獲單元為包含105個小孔的微陣列，蠕動泵將血液樣品從芯片上方泵入進行捕獲．該系統(tǒng)捕獲摻在健康人血液中的MCF-7和HepG2細胞的效率在80%以上．該作者又用8例癌癥病人血液樣品進一步驗證了該系統(tǒng)的可靠性，成功從病人血液中分離出CTCs，整個處理過程僅需1.5h.

  本文關(guān)鍵詞：微流控芯片技術(shù)在循環(huán)腫瘤細胞分離中的研究進展，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。