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生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展

ProgressinBiochemistryandBiophysics2015,42(4):301~312

微流控芯片技術(shù)在循環(huán)腫瘤細(xì)胞

分離中的研究進(jìn)展*

呂曉慶1)李

雷2)**陳紅梅3)陳鵬4)**劉靜2)

移的必要前提[1-2]．微環(huán)境改變的條件下，CTCs又發(fā)生間質(zhì)-上皮轉(zhuǎn)化(mesenchymal-epithelialtransition，MET)而在遠(yuǎn)端器官中停留，生成新的腫瘤，從而導(dǎo)致腫瘤轉(zhuǎn)移[3]．CTCs檢測(cè)在新的腫瘤生物標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)、腫瘤預(yù)后判斷及個(gè)體化治療方面存在很大的應(yīng)用潛力，是國(guó)內(nèi)外腫瘤研究的熱點(diǎn)之一．然而，CTCs在血液中的數(shù)量非常少，109個(gè)血細(xì)胞中僅含有1～10個(gè)CTCs[4]，因此，CTCs研究的關(guān)鍵在于從含有大量血細(xì)胞的復(fù)雜血液樣本中準(zhǔn)確、高效地將其分選出來(lái)[5]，滿足高捕獲率、高純度和高通量的要求，進(jìn)而成為能夠滿足科研和臨床需求的工具．a(chǎn)．高捕獲率，即可以將樣品中的CTCs盡可能多地分離出來(lái)；b．高純度，

它是一個(gè)依賴于免疫磁珠原理的半自動(dòng)化工作系統(tǒng)．該系統(tǒng)通過(guò)連接了抗上皮細(xì)胞黏附分子抗體(epithelialcelladhesionmolecule，EpCAM)的磁珠和CTCs表面標(biāo)志物EpCAM特異性結(jié)合，達(dá)到捕獲CTCs的目的．CTCs的識(shí)別使用經(jīng)典的免疫染色法．該系統(tǒng)分選CTCs效率為80%[6]．盡管

*中國(guó)科學(xué)院重點(diǎn)部署項(xiàng)目(KJZD-EW-TZ-L03-6)，天津市自然科學(xué)基金項(xiàng)目(13JCYBJC23600)，國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(61078074)和中國(guó)博士后科學(xué)基金(2014M550794)資助.**通訊聯(lián)系人.

李雷.Tel:010-82543766,E-mail:lileilei@mail.ipc.ac.cn陳鵬.Tel:022-23340123,E-mail:chenpengdoc@sina.com收稿日期：2015-02-02，接受日期：2015-03-05

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CellSearch已通過(guò)FDA批準(zhǔn)，但該系統(tǒng)還存在一些缺點(diǎn)，比如暫未實(shí)現(xiàn)全自動(dòng)分選、假陽(yáng)性比率高[7]、富集后的CTCs沒(méi)有生物活性等，更重要的是，CellSearch捕獲到的CTCs僅僅是EpCAM陽(yáng)性的類(lèi)型，而許多惡性程度很高的CTCs并不表達(dá)EpCAM，從而無(wú)法被檢測(cè)出來(lái)．

微流控芯片是一個(gè)集樣品制備、反應(yīng)、分離、檢測(cè)等功能于一體的小型分析實(shí)驗(yàn)平臺(tái)，它通過(guò)微加工技術(shù)，在硅、玻璃、聚二甲基硅氧烷

需求，制作出進(jìn)行實(shí)驗(yàn)．將工作簡(jiǎn)化到試劑的消耗靈敏度和分析隨斷擴(kuò)展，分析為一測(cè)[10-11]、細(xì)胞顯示出巨大的應(yīng)用潛力．由于微流控芯片管道尺寸在微米量級(jí)和細(xì)胞尺寸匹配，非常適合應(yīng)用于細(xì)胞分選，近些年來(lái)，有越來(lái)越多的研究者將該技術(shù)應(yīng)用在CTCs的分選上．

微流控芯片分選和富集CTCs的原理主要分為4類(lèi)：a．利用抗原抗體親和性進(jìn)行分選；b．利用細(xì)胞物理特征的不同進(jìn)行分選，比如細(xì)胞大小、變形性以及不同大小的細(xì)胞在流場(chǎng)中的力學(xué)特性；c．利用免疫磁珠具有磁性兼連接抗體的作用進(jìn)行差異進(jìn)行分選總結(jié)了近年的研究現(xiàn)狀和原理進(jìn)行細(xì)胞方法之一道或微結(jié)構(gòu)特異性抗體

(a)A

B(b)C

血液

E

間距不等的微柱

D

過(guò)濾

確定性側(cè)向位移

Fig.1TheschematicofvariousCTCscapturingmicrofluidicchips圖1

微流控芯片捕獲CTCs各類(lèi)芯片結(jié)構(gòu)示意圖

(a)親和性分選法(A:親和性分選芯片原理示意圖;B:親和性分選芯片系統(tǒng)裝置及芯片內(nèi)部微柱顯微照片).(b)物理特征分選法(C:大小-變形性分選微柱捕獲示意圖;D:大小-變形性分選微孔捕獲示意圖;E:確定性側(cè)向位移芯片示意圖).(c)免疫磁珠分選法(F:免疫磁珠捕獲原理示意圖;G:磁珠和大小-變形性方法結(jié)合捕獲示意圖，細(xì)胞與磁珠結(jié)合后，尺寸增加，更有利于細(xì)胞被捕獲).(d)雙向電泳分選法示意圖.

2015;42(4)呂曉慶,等：微流控芯片技術(shù)在循環(huán)腫瘤細(xì)胞分離中的研究進(jìn)展

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或適配體，比如上皮細(xì)胞黏附分子，當(dāng)樣品流經(jīng)微

通道時(shí)，目的細(xì)胞表面抗原與微通道或微結(jié)構(gòu)上的特異性抗體或適配體結(jié)合，細(xì)胞被固定在芯片內(nèi)，其他細(xì)胞隨緩沖液流出芯片；再用合適的方法，比如更換緩沖液，洗脫并收集目的細(xì)胞進(jìn)行下游分析.

He等[14]設(shè)計(jì)了一種由TiO2納米顆粒制備的具有生物相容性納米薄膜，在玻璃基底中旋涂這種納米薄膜，再在薄膜上修飾EpCAM抗體，樣品通過(guò)芯片時(shí)，CTCs結(jié)合在納米薄膜上而留在芯片中．該研究將人結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116混入健康人血液作為待測(cè)樣品，成功分離出HCT116細(xì)胞，其效率約為80%．這種由納米顆粒組成的納米薄膜可以增加抗體和細(xì)胞表面抗原之間的接觸機(jī)率．通過(guò)加大流體剪切力可將約50%的被捕獲細(xì)胞洗脫下來(lái)，洗脫下來(lái)的細(xì)胞具有生物活性，可進(jìn)行體外培養(yǎng)．Sheng等[15]制作了幾何增強(qiáng)混合(geometricallyenhancedmixing)芯片，簡(jiǎn)稱(chēng)“GEMchip”，大小與載玻片相同，芯片中有很多魚(yú)脊形或形結(jié)構(gòu)，8個(gè)并聯(lián)管道用以加大通量．這內(nèi)部的魚(yú)脊形或V形結(jié)構(gòu)形成渦流高胞與抗體之間的接觸機(jī)率，有利于目的細(xì)胞與芯片結(jié)構(gòu)內(nèi)修飾的抗體結(jié)合，，從而高效捕獲CTCs．該研究將人胰腺癌細(xì)胞混入健康人血液作為待測(cè)樣品進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，捕獲效率高達(dá)90%，同樣，被捕獲的腫瘤細(xì)胞可以被洗脫并繼續(xù)培養(yǎng)進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)．Launiere等[16]設(shè)計(jì)了一種內(nèi)部連接EpCAM和E選擇素(E-selectin)的雙抗體芯片，E選擇素用于加大腫瘤細(xì)胞在所受流體剪切力作用下的捕獲效率，與其結(jié)合的白細(xì)胞可以用一種螯合鈣的緩沖液洗脫下來(lái)，腫瘤細(xì)胞則留在芯片內(nèi)．文中還用只修飾EpCAM抗作為對(duì)比，證明這種方法的捕獲效率是抗體的芯片捕獲效率的1.9計(jì)了具有微柱陣列結(jié)構(gòu)系EpCAM表平系NCI-H165的懸液99%，對(duì)于116例腫瘤轉(zhuǎn)(包括胰腺癌、乳腺癌和結(jié)腸癌)到了數(shù)量不等的CTCs．其捕獲CTCs的微流控芯片整理列捕獲單元

TiO2納米顆粒納魚(yú)脊形或V形直線微柱PDMS魚(yú)骨曲線PMMA微管道金納米孔PMMA微管道納米多孔聚碳酸酯膜

硅納米柱子

-：文章中未提．

tocaptureCTCs

CTCs文獻(xiàn)總結(jié)

樣品

HCT116細(xì)胞混于血液L3.6pl細(xì)胞混于血液MCF-7細(xì)胞PBS懸液

NCI-H165細(xì)胞PBS懸液，癌癥病人血液

PC-3細(xì)胞混于血液15例轉(zhuǎn)移性前列腺癌病人血液

MCF-7細(xì)胞混于血液中PANC-1細(xì)胞混于血液PC-3細(xì)胞混于白細(xì)胞MCF-7、PC-3、T-26細(xì)胞混于血液

26例前列腺癌病人血液

捕獲效率/%

8090959991.897-7095

參考文獻(xiàn)[14][15][16][17][18][19][20][21][22]

表Anti-EpCAMAnti-EpCAMAnti-EpCAMAnti-EpCAM

親和性分選法有特異性高的優(yōu)點(diǎn)，能有效分選形狀、大小相似的不同種類(lèi)細(xì)胞．目前大部分研究者采用EpCAM作為CTCs的表面特異性抗原[14-22]，但是在不同的腫瘤亞型中，EpCAM的表達(dá)各不相同，例如乳腺癌細(xì)胞系MCF-7和MDA-MB-231的EpCAM表達(dá)水平不同[23]，并且當(dāng)腫瘤細(xì)胞通過(guò)上

皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)作用傳播時(shí)，EpCAM和角蛋白(CKs)的表達(dá)下調(diào)，波形蛋白(vimentin)和N-鈣黏素(N-cardherin)表達(dá)上調(diào)[24]．依賴EpCAM的CTCs分選芯片會(huì)丟失不表達(dá)或低表達(dá)EpCAM的CTCs，然而這些CTCs具有更大的浸潤(rùn)性和侵入性[25]．因此，缺乏公認(rèn)的表面標(biāo)志物限制了親和性分選在

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CTCs分選中的應(yīng)用．另外，親和性分選法要在通量和效率之間權(quán)衡，流速越大，CTCs和抗體反應(yīng)的時(shí)間越少，這會(huì)導(dǎo)致分選效率降低．親和性分選法與大小變形性分選法相結(jié)合，或使用多抗體修飾的芯片分選CTCs也許是個(gè)不錯(cuò)的解決辦法，但不同種類(lèi)抗體的反應(yīng)緩沖液以及反應(yīng)條件各不相同，實(shí)驗(yàn)成本也會(huì)隨之增加．因此，增加芯片內(nèi)部結(jié)構(gòu)與細(xì)胞接觸的面積和機(jī)率，在芯片內(nèi)部修飾多種抗體捕獲不同蛋白質(zhì)表達(dá)的CTCs，是利用親和性分選法原理分離CTCs的微流控芯片發(fā)展的主要方向．另外這種方法非常適合分選已知表面抗原的目的細(xì)胞，比如血液中的一些免疫細(xì)胞等．

Hosokawa等[29]則用微腔陣列(microcavityarray，MCA)系統(tǒng)捕獲CTCs，該系統(tǒng)的核心結(jié)構(gòu)由100伊100個(gè)8～9滋m直徑的圓孔陣列組成，芯片下面連接蠕動(dòng)泵．實(shí)驗(yàn)中，NCI-H358細(xì)胞混在血液中，蠕動(dòng)泵將樣品從蓄液池吸入芯片，血細(xì)胞通過(guò)圓孔隨緩沖液流出，腫瘤細(xì)胞則由于負(fù)壓作用被固定在圓孔上從而被成功分離．該系統(tǒng)可將混在1ml血液中的10個(gè)腫瘤細(xì)胞在15min內(nèi)完全捕獲，并且保持細(xì)胞活性．染色鑒別結(jié)果證明其分選效率高達(dá)97%，大大同一實(shí)驗(yàn)樣本采用CellSearch系統(tǒng)的等[30]設(shè)計(jì)了一種不同間距的“棘齒”型微，間距依次從18滋m到2滋m樣品呈振蕩流，與垂直方向流速，腫瘤細(xì)胞和膀胱癌細(xì)胞摻在健康在70%以上．Lv等[31]設(shè)計(jì)種間距，該芯片結(jié)構(gòu)分為過(guò)兩過(guò)濾部分的作用是濾掉血液中大限度減少芯片堵塞；捕獲部分則設(shè)計(jì)微柱，間距從12滋m到4滋m遞減，血過(guò)微柱，而腫瘤細(xì)胞則被捕獲，腫瘤細(xì)胞酸鹽緩沖液(phosphatebufferedsaline，PBS)液樣品的捕獲效率高達(dá)90%以上．其他基于細(xì)胞大小和變形性差異原理捕獲循環(huán)腫瘤細(xì)胞的微流控芯片整理列于表2．

基于細(xì)胞大小和變形性差異分選法捕獲CTCs的優(yōu)勢(shì)在于：a．操作過(guò)程簡(jiǎn)單，樣品只需用緩沖液稀釋?zhuān)恍枰M(jìn)行染色標(biāo)記，檢測(cè)時(shí)直接將稀釋后的全血通入芯片，在出口處收集細(xì)胞即可；b．捕獲效率高；c．能夠?qū)崿F(xiàn)高通量分選；d．成本遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于CellSearch；e．無(wú)需依賴表面標(biāo)志物，分選出的CTCs可以用多種抗體進(jìn)行標(biāo)志物鑒別．該方法存在的問(wèn)題是僅僅基于細(xì)胞尺寸和變形性不同而進(jìn)行過(guò)濾式分選，由于CTCs尺寸和白細(xì)胞有重疊部分，CTCs有可能會(huì)通過(guò)濾網(wǎng)或微柱的間隔，然而這些CTCs由于經(jīng)歷了EMT作用而具有間質(zhì)細(xì)胞特性，更容易發(fā)生轉(zhuǎn)移，惡性程度更高[32]；而且在較大的機(jī)械力作用下，CTCs隨著緩沖液流過(guò)微柱或者濾網(wǎng)時(shí)容易破裂[33]．這些因素會(huì)對(duì)分離純度和細(xì)胞活性造成一定影響，這類(lèi)芯片在設(shè)計(jì)內(nèi)部捕獲單元時(shí)應(yīng)避免使用帶棱角的微柱，比如三角形、長(zhǎng)方形、正方形等，而改用圓形、橢圓形等微柱，減少對(duì)細(xì)胞的損傷．

2物理特征分選

微流控芯片進(jìn)行CTCs分選，常根據(jù)CTCs與血細(xì)胞物理特性(如變形性、大小、流體力學(xué)特性等)的差異，通過(guò)在芯片中設(shè)置不同的微結(jié)構(gòu)將其從血液中分離出來(lái)，常用的微結(jié)構(gòu)包括、微過(guò)濾網(wǎng)和微柱等．

2援1基于細(xì)胞大小和變形性差異

大多數(shù)上皮來(lái)源的CTCs直徑不等，而白細(xì)胞直徑從8～20滋．片內(nèi)部設(shè)計(jì)不同的小于徑、微網(wǎng)、微柱等結(jié)構(gòu)(圖1b(C品流經(jīng)芯片時(shí)，卡內(nèi)，血細(xì)胞則隨液流被結(jié)構(gòu)捕獲時(shí)，由于小，加大緩沖液流速時(shí)，被CTCs則留在芯片內(nèi)，從而達(dá)到分離Abnova公司的CXSystem[27]就是基于此原理分離CTCs的代，該系統(tǒng)還可以動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)CTCs的捕獲過(guò)程．芯片主要結(jié)構(gòu)由圓柱形微柱構(gòu)成，每個(gè)捕獲單元由三個(gè)圓柱排列組成一個(gè)“爪形”結(jié)構(gòu)．捕獲后的CTCs可以進(jìn)行染色鑒別和計(jì)數(shù)，亦可被重新收集繼續(xù)培養(yǎng)進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)，如研究CTCs的分子生物學(xué)特征、建立動(dòng)物模型、臨床個(gè)體病例研究等．

Lim等[28]設(shè)計(jì)了一種微篩芯片，該芯片由硅片加工而成，其捕獲單元為包含105個(gè)小孔的微陣列，蠕動(dòng)泵將血液樣品從芯片上方泵入進(jìn)行捕獲．該系統(tǒng)捕獲摻在健康人血液中的MCF-7和HepG2細(xì)胞的效率在80%以上．該作者又用8例癌癥病人血液樣品進(jìn)一步驗(yàn)證了該系統(tǒng)的可靠性，成功從病人血液中分離出CTCs，整個(gè)處理過(guò)程僅需1.5h.

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