本文選題：氧化鈰納米材料 + 肝癌�。� 參考：《第三軍醫(yī)大學》2016年碩士論文

【摘要】：背景:氧化鈰納米材料(CNPs)因為其抗氧化性能,現(xiàn)目前已經(jīng)有大量的研究用于各種疾病的治療,特別是腫瘤的治療。目前的研究主要是氧化鈰納米材料(CNPs)的細胞毒性,可以殺傷腫瘤細胞,限制腫瘤的侵襲,也可以增加腫瘤細胞對放療的敏感性。一些高分子聚合物可以通過錨定在氧化鈰的表面,增加氧化鈰的生物學性能,提高殺傷腫瘤細胞的能力,而對正常的細胞和組織沒有什么影響。但是以上研究均是在較高濃度氧化鈰納米材料(CNPs)(≥10μg/ml)作用下產(chǎn)生的生物學效應,主要是在動物體內(nèi)得出的實驗結(jié)果,對人體來說,濃度太高,可能會產(chǎn)生相應的一些副作用,很難應用于臨床,然而低濃度的氧化鈰納米材料(CNPs)(≤1μg/ml)是否對腫瘤細胞產(chǎn)生影響,包括腫瘤細胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移等,目前尚未有報道。在本研究中,我們發(fā)現(xiàn)通過阿倫磷酸鈉將PEG600錨定在氧化鈰納米材料表面,可以增加氧化鈰納米材料的穩(wěn)定性,而且低濃度(0.01μg/ml)的CNPs-AL-PEG600可以通過活化AKT/ERK信號通路,促進肝癌細胞的增殖,為氧化鈰納米材料治療腫瘤的生長提供了新的有意義的信息。目的:1、低濃度氧化鈰納米材料(CNPs)可以促進肝癌細胞增殖;2、低濃度氧化鈰納米材料(CNPs)通過活化AKT/ERK信號通路促進肝癌細胞增殖。方法:1、細胞培養(yǎng):將凍存在本實驗室液氮罐中的肝癌細胞Hep G2、Huh7、7721、HCT116、MCF-7以及U2OS復蘇,復蘇后用含10%胎牛血清的DMEM在37℃、5%CO2的細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng);2、細胞增殖實驗:用CCK-8法檢測細胞增殖。將對數(shù)生長期的六種腫瘤細胞Hep G2、Huh7、7721、HCT116、MCF-7以及U2OS配制成1×104/ml單細胞懸濁液,將每種細胞分為六組,分別加入濃度為0、0.005、0.01、0.05、0.1、1μg/ml的納米材料,接種于96孔板中,在37℃、5%CO2的細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)24小時。24小時后取出96孔板,每個孔中加入CCK-8試劑10μl,繼續(xù)孵育2小時后,用酶標儀檢測450nm處各孔的吸收度(OD值),測3次,取平均值;3、實時熒光定量PCR檢測與凋亡相關(guān)的基因Bcl-2以及Bax m RNA的表達:肝癌細胞Hep G2、Huh7、7721經(jīng)低濃度氧化鈰納米材料(CNPs)處理24小時后,用Trizol法提取細胞總RNA,用核酸濃度測量儀測濃度,根據(jù)Ta Ka Ra的RT-PCR試劑盒說明書,兩步法逆轉(zhuǎn)錄合成c DNA,按組分配制PCR反應液,進行q RT-PCR反應,內(nèi)參為GAPDH,Bcl-2基因上游引物:ATCg CCCTg Tgg ATg ACTg Ag T,下游引物:g CC Agg Ag AAATCAAACAg Agg C;Bax基因上游引物:TCAgg ATg Cg TCCACCAAg AAg,下游引物:Tg Tg TC CACgg Cgg CAATCATC;反應條件為:95℃,1min;95℃,10s;60℃,15s;72℃,30s,重復40次。最后進行統(tǒng)計學分析;4、基因微陣列分析:將Hep G2細胞接種于6孔板中,分為2組,每組3個復孔,分別為未給予氧化鈰納米材料處理的對照組和給予低濃度(0.01μg/ml)氧化鈰納米材料處理的實驗組,在37℃、5%CO2的細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)24小時后,用PBS沖洗6孔板,每孔細胞用Trizol處理后,提取總RNA,轉(zhuǎn)移到EP管中,在-80°C冰箱中保存。將標本送于上海其明信息技術(shù)有限公司做檢測;5、基因分析和信號通路分析:由上海其明信息技術(shù)有限公司完成;6、免疫印跡實驗:將濃度為0.01μg/ml氧化鈰納米材料與肝癌細胞Hep G2共孵育,分別提取共孵育0.5h、1h、2h的蛋白,以未用氧化鈰納米材料刺激的肝癌細胞Hep G2中提取的蛋白為對照,分別檢測AKT,p AKT,ERK和p ERK抗體在不同時間段的表達量,內(nèi)參為GAPDH;7、裸鼠皮下成瘤實驗:購買10只6-7周齡裸鼠,隨機分為2組并稱體重,1組為對照組,1組為實驗組。將1×106Hep G2細胞重懸于100μl PBS中,然后皮下注射兩組裸鼠的右側(cè)腹股溝。第二天開始,每隔一日在實驗組裸鼠腹腔內(nèi)注射劑量為0.01mg/kg的氧化鈰納米材料(CNPs),對照組注射同等劑量的PBS。30天后處死裸鼠,取下瘤體稱重;8、統(tǒng)計學分析:用平均值±標準差表示計量資料數(shù)據(jù),用Graph Pad Prism5軟件進行統(tǒng)計學分析,兩組間的差異比較采用t檢驗,差異性檢驗水準設為P0.05。結(jié)果:1、低濃度氧化鈰納米材料(CNPs)促進肝癌細胞增殖;2、低濃度氧化鈰納米材料(CNPs)減少肝癌細胞的凋亡;3、低濃度氧化鈰納米材料(CNPs)通過活化AKT/ERK信號通路促進肝癌細胞增殖;4、在體內(nèi)低濃度氧化鈰納米材料(CNPs)促進腫瘤生長。結(jié)論:1、通過CCK-8實驗證實,濃度為0.01μg/ml的CNPs-AL-PEG600促進肝癌細胞增殖;2、CNPs-AL-PEG600實驗組細胞里凋亡相關(guān)基因Bcl-2/Bax比值較對照組升高,表明CNPs-AL-PEG600通過減少細胞凋亡途徑來促進肝癌細胞增殖;3、基因芯片分析,CNPs-AL-PEG600可能是通過活化AKT/ERK信號通路促進肝癌細胞增殖;4、WB實驗證實CNPs-AL-PEG600是通過活化AKT/ERK信號通路促進肝癌細胞增殖;5、在小鼠體內(nèi)實驗證實濃度為0.01mg/kg的CNPs-AL-PEG600促進腫瘤生長。
[Abstract]:Background: ceria nanomaterials (CNPs) have been widely studied for the treatment of various diseases, especially tumors, because of their antioxidant properties. The current research is mainly on the cytotoxicity of cerium oxide nanomaterials (CNPs), which can kill tumor cells, restrict tumor invasion, and increase tumor cells to radiotherapy. Sensitivity. Some polymers can be anchored to the surface of cerium oxide, increasing the biological properties of cerium oxide, improving the ability to kill tumor cells, and not affecting normal cells and tissues. But the above study is the biology produced under the action of high concentration of cerium oxide nanomaterials (CNPs) (> 10 mu g/ml). The effect, mainly the experimental results in animals, is too high for the human body, which may produce some side effects and is difficult to apply to the clinic. However, the low concentration of cerium oxide nanomaterial (CNPs) (less than 1 mu g/ml) affects the tumor cells, including the proliferation, invasion and metastasis of tumor cells and so on. In this study, we found that the stability of cerium oxide nanomaterials can be increased by anchoring PEG600 on the surface of ceria nanomaterials by Allen phosphate, and the low concentration (0.01 mu g/ml) of CNPs-AL-PEG600 can promote the proliferation of hepatoma cells by activating the AKT/ERK signaling pathway and the treatment of tumors for cerium oxide nanomaterials. Growth provides new and meaningful information. Objective: 1, low concentration cerium oxide nanomaterials (CNPs) can promote the proliferation of hepatoma cells; 2, low concentration cerium oxide nanomaterials (CNPs) promote the proliferation of hepatoma cells by activating AKT/ERK signaling pathway. Methods: 1, cell culture: Hep G2, Huh77721, frozen in the liquid nitrogen tank in our laboratory HCT116, MCF-7 and U2OS resuscitation, after resuscitation, DMEM in the cell culture box containing 10% fetal bovine serum was cultured at 37, 5%CO2 cell culture box; 2, cell proliferation experiment: CCK-8 method was used to detect cell proliferation. The six tumor cells of the logarithmic growth period Hep G2, Huh77721, HCT116, MCF-7, and U2OS were prepared into 1 x cell suspensions, and each cell was divided into six groups The nanomaterials with a concentration of 0,0.005,0.01,0.05,0.1,1 mu g/ml were inoculated in 96 Kong Banzhong, respectively, and 96 holes were taken out after 24 hours of.24 hours in the cell culture box of 5%CO2 at 37 degrees C. The CCK-8 reagent 10 micron l was added to each hole for 2 hours, and the absorbance (OD) of the pores in 450nm was detected by the enzyme labeling instrument, and the average value was measured for 3 times, and 3, real. The fluorescence quantitative PCR was used to detect the gene Bcl-2 and the expression of Bax m RNA: the hepatocellular carcinoma cell Hep G2, Huh77721 was treated with the low concentration of cerium oxide nanomaterial (CNPs) for 24 hours, and the cell total RNA was extracted by Trizol method, and the concentration was measured by the nucleic acid concentration measuring instrument. PCR reaction liquid is prepared according to the component, Q RT-PCR reaction, internal reference is GAPDH, Bcl-2 gene upstream primers: ATCg CCCTg Tgg ATg ACTg Ag T, upstream primers are primers: 95 degrees, 95 degrees, 60 degrees, 7; 2 degrees, 30s, repeated 40 times. Finally, statistical analysis was carried out; 4, gene microarray analysis: Hep G2 cells were inoculated into 6 orifice plates and divided into 2 groups, each group was treated with no cerium oxide nanomaterials and the experimental group treated with low concentration (0.01 mu g/ml) ceria nanomaterials, at 37, 5%CO2 cell culture box culture. After 24 hours, 6 holes were flushed with PBS. After each cell was treated with Trizol, the total RNA was extracted and transferred to the EP tube and stored in -80 C refrigerator. The specimens were sent to Shanghai its Ming Information Technology Co., Ltd. for testing; 5, gene analysis and signal pathway analysis were completed by Shanghai's Mingxin Technology Co., Ltd.; 6, immunoblotting experiment: the concentration of 0 .01 mu g/ml cerium oxide nanomaterials were incubated with Hep G2 of liver cancer cells, and the protein of 0.5h, 1H, 2h was incubated respectively. The proteins extracted from Hep G2 stimulated by ceria nanomaterials were compared. The expression of AKT, P AKT, and the expression of the antibody at different time periods were detected respectively, and 7, subcutaneous tumor formation experiment in nude mice: 10 6-7 week old nude mice were randomly divided into 2 groups and weighed in 2 groups. The 1 group was the control group and the 1 group was the experimental group. 1 x 106Hep G2 cells were suspended in 100 mu L PBS, and then the right groin of two groups of nude mice was injected subcutaneously. At the beginning of the day, the dose of cerium oxide nanomaterials (CNPs) in the peritoneal cavity of the experimental group nude mice were injected every other day, and the control group was compared to the control group every other day. The group was sacrificed to the nude mice after PBS.30 days of the same dose, and the weight of the tumor was weighed. 8, the statistical analysis was made by means of mean standard deviation. The statistical analysis was made with the Graph Pad Prism5 software. The difference of the difference between the two groups was compared with the t test. The difference test level was set as P0.05. results: 1, the low concentration cerium oxide nanomaterial (CNPs). Promote the proliferation of hepatoma cells; 2, low concentration cerium oxide nanomaterial (CNPs) reduces the apoptosis of hepatoma cells; 3, low concentration cerium oxide nanomaterial (CNPs) promotes the proliferation of hepatoma cells by activating the AKT/ERK signal pathway; 4, low concentration of cerium oxide nano material (CNPs) promotes tumor growth in the body. Conclusion: 1, the concentration is 0.01 um by CCK-8 test. The CNPs-AL-PEG600 of g/ml promoted the proliferation of hepatoma cells. 2, the apoptosis related gene Bcl-2/Bax ratio in the CNPs-AL-PEG600 experimental group was higher than that in the control group, indicating that CNPs-AL-PEG600 promoted the proliferation of hepatoma cells by reducing the apoptosis pathway; 3, gene chip analysis, CNPs-AL-PEG600 may promote the liver cancer by activating the AKT/ERK signaling pathway. Cell proliferation; 4, WB experiments confirmed that CNPs-AL-PEG600 promoted the proliferation of hepatoma cells by activating the AKT/ERK signaling pathway; 5, in mice, the experiment confirmed that the CNPs-AL-PEG600 concentration of 0.01mg/kg promoted the growth of the tumor.
【學位授予單位】：第三軍醫(yī)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R735.7

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本文編號：2096057