本文選題：參芪扶正注射液 + 干擾素-α　； 參考：《北京中醫(yī)藥大學(xué)》2017年碩士論文

【摘要】：原發(fā)性肝細(xì)胞癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)是目前世界上最常見的,而且是惡性程度最高的惡性腫瘤之一,位居全球惡性腫瘤死因的第3位。由于較高的乙型肝炎感染率,我國是肝癌的高發(fā)國家,每年至少30萬人死于肝癌,占全世界肝癌死亡人數(shù)的半數(shù)以上,是我國第二位癌癥殺手。近年世界各地肝癌的發(fā)病率有上升的趨勢。經(jīng)過幾十年努力,肝癌的臨床與基礎(chǔ)研究均取得了一定進(jìn)展,但肝癌的總體預(yù)后并沒有得到顯著的改善,其5年生存率僅為3%-5%。手術(shù)仍是目前治療肝癌最有效的方法,但肝癌手術(shù)后總復(fù)發(fā)率高達(dá)50%-100%,術(shù)后高轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)率已成為進(jìn)一步提高遠(yuǎn)期療效的瓶頸,也是攻克肝癌的關(guān)鍵。因此,尋找臨床切實(shí)可用的措施來減少肝癌術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移尤為必要。IFN-α具有抗病毒感染、調(diào)節(jié)免疫功能、抑制細(xì)胞增殖、抗腫瘤新生血管形成等生物學(xué)作用,現(xiàn)已被廣泛應(yīng)用到肝癌等惡性腫瘤的治療研究中。研究顯示大劑量長期使用IFN-α可抑制裸鼠體內(nèi)肝癌細(xì)胞的增殖及侵襲性。目前,IFN-α已成為臨床預(yù)防肝癌術(shù)后復(fù)發(fā)的常規(guī)治療方案之一。但是由于部分肝癌患者不能耐受長期大量使用IFN-α所帶來的不適及副作用,限制了其在臨床上的廣泛應(yīng)用,而且臨床隨機(jī)分組研究發(fā)現(xiàn)肝癌切除術(shù)后給予IFN-α治療雖可延長患者的生存,推遲復(fù)發(fā),但與對照組相比復(fù)發(fā)率并未降低,部分患者在停藥一段時間后再次使用IFN-α療效不佳。究其原因是長期使用IFN-α后肝癌對其產(chǎn)生耐藥性。因此明確肝癌對IFN-α產(chǎn)生耐藥性的原因,并據(jù)此采取有效的針對性措施,將有助于提高IFN-α的療效,降低IFN-α的使用劑量及副作用,降低術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移率,對于提高肝癌患者的預(yù)后具有十分重要的意義。我們研究發(fā)現(xiàn)益氣扶正法的代表藥物參芪扶正注射液可有效抑制肝癌的生長轉(zhuǎn)移,并證實(shí)其可顯著增強(qiáng)肝癌組織內(nèi)STAT1表達(dá),鑒于STAT1的高表達(dá)是降低IFN-a耐藥性的關(guān)鍵,我們推測參芪扶正注射液可有效減少肝癌對IFN-a的耐藥性。本研究通過建立具有肺轉(zhuǎn)移潛能的人肝癌細(xì)胞株MHCC97L及其裸鼠肝癌模型,采用MTT、Transwell、ELISA、熒光定量PCR、Western Blot、免疫組化、寡核苷酸芯片及RNA干擾等技術(shù),系統(tǒng)研究參芪扶正注射液協(xié)同IFN-a抑制肝癌生長轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)的作用,揭示參芪扶正注射液對JAK/STAT信號通路的影響,闡明參芪扶正注射液降低IFN-a耐藥性的機(jī)制,為臨床聯(lián)合使用參芪扶正注射液和IFN-a防治肝癌術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移提供理論依據(jù)。研究目的:1.觀察參芪扶正注射液協(xié)同IFN-α抑制肝癌細(xì)胞MHCC97L增殖及侵襲的作用;2.構(gòu)建STAT1基因"沉默"的肝癌細(xì)胞MHCC97L瘤株,并驗(yàn)證其STAT1基因表達(dá)抑制效果;3.在STAT1基因"沉默"的MHCC97L瘤株上檢驗(yàn)其侵襲性及增殖能力,從而驗(yàn)證參芪扶正注射液協(xié)同IFN-α抑制肝癌細(xì)胞的機(jī)制。研究方法:1.觀察參芪扶正注射液協(xié)同IFN-α抑制肝癌細(xì)胞MHCC97L增殖及侵襲的作用;1.1通過MTT實(shí)驗(yàn)研究參芪扶正注射液協(xié)同IFN-α對MHCC97L瘤株增殖作用的影響培養(yǎng)復(fù)旦大學(xué)肝癌研究所建立的具有肺轉(zhuǎn)移潛能的人肝癌細(xì)胞株MHCC97L,通過細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)(MTT)檢測小劑量參芪扶正注射液及IFN-α單獨(dú)或聯(lián)合使用對MHCC97L細(xì)胞增殖的影響;1.2通過體外侵襲實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)研究參芪扶正注射液協(xié)同IFN-α對MHCC97L瘤株侵襲性的影響通過體外侵襲實(shí)驗(yàn)(Transwell)檢測參芪扶正注射液及IFN-α單獨(dú)或聯(lián)合使用對MHCC97L細(xì)胞侵襲性的影響Western Blot/RT-PCR實(shí)驗(yàn)檢測參芪扶正注射液及IFN-α單獨(dú)或聯(lián)合使用對MHCC97L細(xì)胞STAT1表達(dá)的影響。2.構(gòu)建STAT1基因"沉默"的肝癌細(xì)胞MHCC97L瘤株,并驗(yàn)證其STAT1基因表達(dá)抑制效果:收集前一實(shí)驗(yàn)獲取的腫瘤細(xì)胞(大劑量IFN-α單獨(dú)治療組及參芪扶正注射液和IFN-α聯(lián)合治療組肝癌細(xì)胞);用SuperArrαy公司JAK/STAT信號通路寡核苷酸芯片篩選上述肝癌組織差異表達(dá)基因(該芯片包含所有已知的JAK/STAT家族成員、激活JAK/STAT信號通路的受體、STAT蛋白相關(guān)的核輔助因子及共同活化因子、STAT誘導(dǎo)蛋白及負(fù)反饋調(diào)節(jié)蛋白);Western Blot及熒光定量PCR技術(shù)從蛋白質(zhì)及mRNA水平驗(yàn)證寡核苷酸芯片篩選出的差異表達(dá)基因。3.在STAT1基因"沉默"的MHCC97L瘤株上檢驗(yàn)其侵襲性及增殖能力:3.1通過MTT實(shí)驗(yàn)研究參芪扶正注射液協(xié)同IFN-α對MHCC97L瘤株增殖作用的影響:培養(yǎng)STAT1基因"沉默"的MHCC97L瘤株,通過細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)(MTT)檢測小劑量參芪扶正注射液及IFN-α單獨(dú)或聯(lián)合使用對STAT1基因"沉默"的MHCC97L細(xì)胞增殖的影響;3.2通過體外侵襲實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)研究參芪扶正注射液協(xié)同IFN-α對STAT1基因"沉默"的MHCC97L瘤株侵襲性的影響;通過體外侵襲實(shí)驗(yàn)(Transwell)檢測參芪扶正注射液及IFN-α單獨(dú)或聯(lián)合使用對STAT1基因"沉默"的MHCC97L細(xì)胞侵襲性的影響。研究結(jié)果:MTT實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn):與單獨(dú)使用IFN-α比較,參芪扶正注射液聯(lián)合IFN-α可顯著增強(qiáng)對人肝癌MHCC97-L的抑制作用;Transwell實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn):參芪扶正注射液聯(lián)合小劑量 IFN-α 組 MHCC97L 細(xì)胞遷移個數(shù)(17.67±1.53)與小劑量 IFN-α 組(27.67±3.06)細(xì)胞遷移個數(shù)相比較顯著降低;RT-PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:參芪扶正注射液組的MHCC97L細(xì)胞STAT1 mRNA的表達(dá)量明顯高于NaCl陰性對照組,說明0.5g/L的參芪扶正注射液可以有效上調(diào)肝癌細(xì)胞MHCC97L的STAT1 mRNA表達(dá)。而IFN-α組與陰性對照組相比較無顯著性差異;Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:參芪扶正注射液組的MHCC97L細(xì)胞STAT1蛋白質(zhì)的表達(dá)量明顯高于NaCl陰性對照組,說明0.5g/L的參芪扶正注射液可以有效上調(diào)肝癌細(xì)胞MHCC97L的STAT1蛋白質(zhì)表達(dá)。而IFN-α組與陰性對照組相比較無顯著性差異;通過RNAi有效實(shí)現(xiàn)了 MHCC97L的STAT1基因過表達(dá),并成功構(gòu)建了 STAT1基因RNAi病毒載體質(zhì)粒,經(jīng)慢病毒載體轉(zhuǎn)染人肝癌細(xì)胞MHCC97L后,STAT1基因在mRNA水平及蛋白質(zhì)水平出現(xiàn)了明顯抑制;參芪扶正注射液聯(lián)合IFN-α對STAT1基因"沉默"后的MHCC97L細(xì)胞株的抑制作用與陰性對照組(P0.05)和IFN-α組(P0.05)相比較無顯著性差異;通過Transwell實(shí)驗(yàn),結(jié)果顯示STAT1基因"沉默"后,參芪扶正注射液聯(lián)合小劑量IFN-α組中MHCC97L細(xì)胞的遷移個數(shù)(28.00±2.00)與小劑量IFN-α組(28.33±4.04)相比無顯著性差異。結(jié)論:參芪扶正注射液在治療肝細(xì)胞癌的過程中,可以通過提高STAT1的基因表達(dá),達(dá)到針對IFN-α的增效作用。
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【學(xué)位授予單位】：北京中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R735.7

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：1758368