本文關(guān)鍵詞：TRAF2和RIP1介導(dǎo)的JNK激活誘導(dǎo)的自噬存活通路降低TRAIL誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的機(jī)制研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

《重慶醫(yī)科大學(xué)》 2013年

TRAF2和RIP1介導(dǎo)的JNK激活誘導(dǎo)的自噬存活通路降低TRAIL誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的機(jī)制研究

何衛(wèi)陽(yáng)  

【摘要】：目的： 本課題以體外培養(yǎng)的多種腫瘤細(xì)胞為研究對(duì)象,通過TRAIL進(jìn)行干預(yù)，觀察TRAIL能否誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞自噬以及自噬在TRAIL誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞自噬中的作用，從細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)通路及蛋白水平探討TRAIL誘導(dǎo)自噬以及自噬對(duì)不同腫瘤細(xì)胞增殖、凋亡影響的作用機(jī)制。為增強(qiáng)TRAIL的療效以及逆轉(zhuǎn)TRAIL的耐藥腫瘤奠定實(shí)驗(yàn)理論基礎(chǔ)。 方法： 應(yīng)用TRAIL處理體外培養(yǎng)的UM-UC-3、A549以及PC-3，然后應(yīng)用LDH檢測(cè)TRAIL細(xì)胞毒性，應(yīng)用Western blot檢測(cè)自噬相關(guān)蛋白表達(dá)變化，通過熒光顯微鏡檢測(cè)自噬體的變化明確TRAIL能否誘導(dǎo)自噬。然后應(yīng)用自噬抑制劑WTM、CQ以及沉默自噬關(guān)鍵基因ATG7以及Beclin-1抑制自噬觀察對(duì)TRAIL誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的影響，探明自噬在TRAIL誘導(dǎo)凋亡中的作用。應(yīng)用Western blot檢測(cè)凋亡信號(hào)通路蛋白Caspase8、Caspase3以及PARP的變化；應(yīng)用自噬抑制劑CQ抑制自噬檢測(cè)對(duì)TRAIL誘導(dǎo)死亡復(fù)合體的影響，應(yīng)用GST Pull Down檢測(cè)死亡復(fù)合體蛋白Caspase8、FADD以及RIP1表達(dá)的變化，明確自噬對(duì)凋亡和死亡復(fù)合體的影響。應(yīng)用JNK抑制劑SP、NF-kB抑制劑IKK2Inhibitor抑制JNK及NF-kB信號(hào)通路，觀察其對(duì)自噬以及TRAIL誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的影響，應(yīng)用Western blot檢測(cè)自噬相關(guān)蛋白LC-3B以及凋亡信號(hào)通路蛋白Caspase8、Caspase3以及PARP的變化，探明調(diào)節(jié)自噬的信號(hào)通路。應(yīng)用TRAIL處理體外培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞UM-UC-3以及A549，然后應(yīng)用Western blot檢測(cè)Bcl-2家族蛋白的表達(dá)，通過免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation,Co-IP）檢測(cè)Beclin1-Bcl2/Bcl-xl復(fù)合體的變化；以及抑制JNK和NF-kB通路對(duì)上述蛋白變化的影響，明確TRAIL誘導(dǎo)自噬的可能機(jī)制。應(yīng)用JNK抑制劑SP、自噬抑制劑WTM抑制JNK及自噬信號(hào)通路，然后應(yīng)用Western blot檢測(cè)對(duì)抗凋亡蛋白家族表達(dá)的影響；然后再應(yīng)用自噬抑制劑CQ、CathepsinB、溶酶體抑制劑MG-132、凋亡抑制劑z-VAD以及JNK抑制劑SP，觀察其對(duì)TRAIL誘導(dǎo)的抗凋亡蛋白家族降解的影響，探明自噬對(duì)抗凋亡蛋白降解的影響。最后沉默RIP1以及TRAF2，觀察其對(duì)自噬水平的影響以及對(duì)TRAIL誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的影響，應(yīng)用LDH檢測(cè)腫瘤細(xì)胞死亡以及應(yīng)用Western blot檢測(cè)自噬蛋白LC-3Ⅱ表達(dá)的變化，探明JNK激活介導(dǎo)的TRAIL誘導(dǎo)自噬的上游信號(hào)通路。 結(jié)果： TRAIL可以誘導(dǎo)膀胱腫瘤細(xì)胞UM-UC-3、肺癌細(xì)胞A549以及前列腺癌細(xì)胞PC-3自噬；主要表現(xiàn)為L(zhǎng)C-3II表達(dá)增加、“自噬潮”的形成以及自噬體的顯著增加。TRAIL誘導(dǎo)的自噬對(duì)腫瘤細(xì)胞起保護(hù)作用，無論是應(yīng)用藥物抑制劑3MA、WTM或CQ還是沉默自噬關(guān)鍵基因ATG7或Beclin-1抑制自噬，均能顯著增強(qiáng)TRAIL的細(xì)胞毒性。自噬可以抑制TRAIL誘導(dǎo)的凋亡信號(hào)通路，，抑制自噬可增強(qiáng)TRAIL誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，以及死亡復(fù)合體的形成。抑制JNK可以抑制自噬，進(jìn)而明顯增強(qiáng)TRAIL誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性。TRAIL誘導(dǎo)的自噬主要通過Bcl-xl的降解以及Bcl-xl/Beclin1復(fù)合體的分離來實(shí)現(xiàn)的；而抑制JNK可以抑制Bcl-xl的降解并可以促進(jìn)Bcl-xl/Beclin1復(fù)合體的重新結(jié)合。JNK介導(dǎo)的自噬參與了抗凋亡蛋白的降解，抑制JNK或抑制自噬均能顯著促進(jìn)抗凋亡蛋白cIAP1、cIAP2、XIAP以及c-FLIP的降解。RIP1以及TRAF2調(diào)節(jié)JNK激活誘導(dǎo)自噬的產(chǎn)生。沉默RIP1以及TRAF2均能有效地抑制自噬，并能顯著增強(qiáng)TRAIL誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡。 結(jié)論： TRAIL可以誘導(dǎo)多種腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生保護(hù)性自噬；而RIP1和TRAF2介導(dǎo)的JNK激活是TRAIL誘導(dǎo)自噬的上游信號(hào)；Bcl-xl的降解以及Bcl-xl/Beclin1復(fù)合體的分離是TRAIL誘導(dǎo)自噬的主要機(jī)制。抑制JNK介導(dǎo)的自噬可能是提高腫瘤對(duì)TRAIL敏感性的一個(gè)新的切入點(diǎn)。

【關(guān)鍵詞】：
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號(hào)】：R73-36
【目錄】：

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本文編號(hào)：163133