本文關(guān)鍵詞： 結(jié)腸癌 miR-223 p120 miR-223 p120 E-cadherin RhoA β-catenin　出處：《華中科技大學(xué)》2016年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：第一部分miR-223與p120在結(jié)腸癌中的表達(dá)特征及二者之間靶向調(diào)控關(guān)系的鑒定目的探索miR-223和p120 catenin (p120)在結(jié)腸癌組織中的表達(dá),分析二者表達(dá)與臨床病理特征之間的關(guān)系,以及二者表達(dá)之間的相關(guān)性,預(yù)測(cè)p120為miR-223靶基因的可能性。方法采用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)80例結(jié)腸癌組織和42例對(duì)應(yīng)癌旁正常結(jié)腸組織中p120的表達(dá)分布情況；采用Real Time PCR檢測(cè)18例結(jié)腸癌組織和對(duì)應(yīng)正常結(jié)腸組織中miR-223的表達(dá)情況,并分析其與臨床病理特征之間的關(guān)系,及二者表達(dá)之間的相關(guān)性。利用生物信息學(xué)分析,預(yù)測(cè)p120為miR-223靶基因的可能性；采用雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)予以驗(yàn)證。進(jìn)一步在人類結(jié)腸癌LoVo細(xì)胞中過(guò)表達(dá)miR-223類似物,分別用Real Time PCR和Western blot檢測(cè)p120 mRNA和蛋白表達(dá)水平予以驗(yàn)證。結(jié)果(1)免疫組化顯示：在結(jié)腸癌組織和正常結(jié)腸組織中,p120異常表達(dá)率分別為71.25%和0%(P0.05),兩組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。(2)在低分化癌、中分化癌和高分化癌組織中p120異常表達(dá)率分別為91.67%、43.48%和33.33%(P0.05),在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的組織中p120異常表達(dá)率分別為85.29%和60.87%(P0.05),在Dukes分期C-D期的患者和A-B期的患者中p120異常表達(dá)率分別為85.71%和58.70%(P0.05),組間p120異常表達(dá)率差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；而p120異常表達(dá)率在不同年齡、性別、腫瘤大小、腫瘤位置、浸潤(rùn)深度等情況之間的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。(3) Real Time PCR顯示：miR-223在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)量較正常結(jié)腸組織高,兩組間比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05);且miR-223表達(dá)量在低分化癌組織中顯著高于中分化和高分化癌組織(P0.05),在浸潤(rùn)深度為T(mén)4的組織中顯著高于T1-T3的組織(P0.05),在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的組織中顯著高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的組織(P0.05),在Dukes分期C-D期的組織中顯著高于A-B期的組織(P0.05)。(4)在結(jié)腸癌組織中,p120的表達(dá)與miR-223的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(r=-0.575,P=0.013)。(5)生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)TargetScan和MicroRNA.org都預(yù)測(cè)miR-223的5’種子區(qū)域可以與p120mRNA的3'UTR區(qū)域互補(bǔ)結(jié)合。雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)顯示：與陰性對(duì)照組相比,在共轉(zhuǎn)染miR-223類似物的條件下,p120-3'UTR WT載體熒光素酶活性下降(P0.05),而p120-3'UTR Mut載體熒光素酶活性無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。(6)在人類結(jié)腸癌LoVo細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-223類似物后,與陰性對(duì)照組相比,Real Time PCR顯示p120 mRNA表達(dá)水平顯著降低(P0.001); Western blot顯示p120的蛋白表達(dá)水平也顯著降低(P0.05)。結(jié)論miR-223的表達(dá)增高和p120的表達(dá)異常都與結(jié)腸癌的惡性程度相關(guān),且p120與miR-223表達(dá)呈負(fù)相關(guān),在結(jié)腸癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中,miR-223可能通過(guò)靶向腫瘤抑制因子p120,負(fù)性調(diào)節(jié)p120表達(dá),從而促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為。第二部分miR-223對(duì)LoVo結(jié)腸癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響及其機(jī)制研究目的觀察miR-223對(duì)LoVo細(xì)胞生物學(xué)行為的影響,并初步探討其對(duì)下游信號(hào)通路的調(diào)節(jié)作用,以明確miR-223作為一個(gè)癌基因的分子機(jī)制。方法在LoVo細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-223類似物或者抑制劑,采用MTT法觀察其對(duì)LoVo細(xì)胞增殖能力的影響;采用細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)觀察其對(duì)細(xì)胞遷移能力的影響；采用基質(zhì)膠侵襲實(shí)驗(yàn)觀察其對(duì)細(xì)胞侵襲能力的影響。并應(yīng)用Western blot檢測(cè)其對(duì)E-cad和VIM表達(dá)的影響;采用G-LISA檢測(cè)其對(duì)RhoA活性的影響；采用核漿蛋白分離提取、免疫熒光等方法檢測(cè)其對(duì)β-catenin入核的影響；采用Western blot和Real Time PCR檢測(cè)其對(duì)c-Myc和CyclinD1的蛋白表達(dá),以及對(duì)MMP7的mRNA和蛋白表達(dá)水平的影響。結(jié)果(1)MTT結(jié)果顯示：在轉(zhuǎn)染miR-223類似物組,細(xì)胞增殖能力較陰性對(duì)照組增強(qiáng),而轉(zhuǎn)染miR-223抑制劑組細(xì)胞增殖能力較陰性對(duì)照組減弱。(2)細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)顯示：與陰性對(duì)照組相比,劃痕48 h后,轉(zhuǎn)染miR-223類似物組細(xì)胞劃痕之間出現(xiàn)兩側(cè)細(xì)胞互相融合的現(xiàn)象,而轉(zhuǎn)染miR-223抑制劑組細(xì)胞劃痕之間仍有較大面積。(3) Transwell細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)顯示：與陰性對(duì)照組相比,轉(zhuǎn)染miR-223類似物組遷移細(xì)胞數(shù)量增多,而轉(zhuǎn)染miR-223抑制劑組遷移細(xì)胞數(shù)量減少。(4)基質(zhì)膠侵襲實(shí)驗(yàn)顯示：與陰性對(duì)照組相比,轉(zhuǎn)染miR-223類似物組穿過(guò)基質(zhì)膠的細(xì)胞數(shù)量增多,而轉(zhuǎn)染miR-223抑制劑組穿過(guò)基質(zhì)膠的細(xì)胞數(shù)量減少。(5) Western blot結(jié)果顯示：轉(zhuǎn)染miR-223類似物組p120表達(dá)降低、E-cad表達(dá)也降低,而VIM表達(dá)增加；轉(zhuǎn)染miR-223抑制劑組p120表達(dá)增加,而E-cad和VIM無(wú)明顯改變。(6) G-LISA檢測(cè)結(jié)果顯示：轉(zhuǎn)染miR-223類似物和p120 siRNA組,RhoA的活性明顯增加。(7)核漿蛋白分離提取結(jié)果顯示：轉(zhuǎn)染miR-223類似物組細(xì)胞核中β-catenin的表達(dá)增加；免疫熒光結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)染miR-223類似物組β-catenin入核增加。(8) Western blot和Real Time PCR結(jié)果顯示：轉(zhuǎn)染miR-223類似物組c-Myc和CyclinD1的蛋白表達(dá)增加：且MMP7的mRNA和蛋白表達(dá)水平都增加。結(jié)論miR-223可能通過(guò)靶向p120降低細(xì)胞間粘附、增強(qiáng)RhoA活性、激活β-catenin信號(hào)通路而促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。
[Abstract]:The expression of miR - 223 and p120 in colon cancer tissues and the correlation between the expression of miR - 223 and p120 in normal colon tissues were analyzed . ( 4 ) The expression of miR - 223 was negatively correlated with the expression of miR - 223 in colon cancer tissues ( r = - 0.575 , P = 0 . 013 ) . ( 4 ) Compared with the negative control group , the number of cells transfected with miR - 223 analog group increased and the number of cells transfected with miR - 223 inhibitor group decreased . ( 8 ) Western blot and Real Time PCR showed that the expression of c - Myc and Cyclin D1 transfected with miR - 223 increased : and the mRNA and protein expression levels of MMP - 7 increased . Conclusion miR - 223 may promote the proliferation , migration and invasion of colon cancer cells by targeting p120 to reduce inter - cell adhesion , enhance RhoA activity , and activate the 尾 - catenin signaling pathway .

【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R735.35

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7 宋e，

本文編號(hào)：1497053