發(fā)布時間：2018-02-09 04:32

  本文關鍵詞： microRNA-200a-3p SPAG9 腎細胞癌 增殖 細胞周期 凋亡 遷移 侵襲　出處：《吉林大學》2016年博士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：目的:研究micro RNA-200a-3p對腎細胞癌細胞生長、凋亡、遷移、侵襲等生物學行為的影響及相關的作用機制,探尋治療腎細胞癌的靶基因。方法:1.運用實時定量PCR方法,驗證mi R-200a-3p在正常腎組織與腎細胞癌組織以及正常腎小管上皮細胞與腎細胞癌細胞中的表達情況。2.將mi R-200a-3p mimics轉(zhuǎn)染腎細胞癌細胞786-O和ACHN細胞,通過MTT、平板克隆形成實驗、transwell小室遷移和侵襲實驗、PI單染檢測細胞周期以及Annexin V-FITC/PI雙染檢測細胞凋亡等方法研究mi R-200a-3p對腎細胞癌細胞786-O、ACHN功能的影響。裸鼠皮下腎腫瘤模型分析mi R-200a-3p對腫瘤生長的影響。3.應用生物信息學軟件預測mi R-200a-3p的靶基因,構建雙熒光素酶報告基因驗證mi R-200a-3p與其靶基因,運用實時定量PCR及western blot方法進一步驗證靶向關系。4.運用實時定量PCR方法、免疫組織化學染色及免疫細胞化學染色驗證SPAG9在正常腎組織與腎細胞癌組織以及正常腎小管上皮細胞與腎細胞癌細胞中的表達情況。5.將si-SPAG9轉(zhuǎn)染腎細胞癌細胞786-O和ACHN細胞,通過MTT、平板克隆形成實驗、transwell小室遷移和侵襲實驗、PI單染檢測細胞周期以及Annexin V-FITC/PI雙染檢測細胞凋亡等方法研究沉默SPAG9對腎細胞癌細胞786-O、ACHN功能的影響。將mi R-200a-3p mimics和pc DNA3.1-SPAG9質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染入腎細胞癌細胞,設計“挽救”實驗。6.查閱文獻選擇腫瘤惡性特征相關的基因,Western blot分析過表達mi R-200a-3p、敲除SPAG9及共轉(zhuǎn)染mi R-200a-3p mimics和pc DNA3.1-SPAG9質(zhì)粒對腎癌細胞786-O中p21、cyclin D1、bcl-2、Bax以及MMP9蛋白表達的影響。結果:1.相對于人正常腎組織,mi R-200a-3p在腎細胞癌組織中的相對表達水平明顯下降,下降幅度約為53.2%(P0.001)。相對于人正常腎小管上皮細胞,mi R-200a-3p在腎細胞癌細胞系786-O與ACHN細胞中的相對表達水平也明顯下降,下降幅度分別約為73.1%(P0.05)和82.6%(P0.01)。2.mi R-200a-3p mimics使786-O和ACHN細胞mi R-200a-3p的表達水平明顯升高,分別是mi R-NC組的1067倍和889倍。MTT實驗結果顯示,細胞接種96孔板轉(zhuǎn)染72h后,轉(zhuǎn)染mi R-200a-3p組與NC對照組比較,OD490值明顯下降,增殖活性明顯減低(P0.05)�？寺⌒纬蓪嶒灲Y果顯示,轉(zhuǎn)染mi R-200a-3p組與NC對照組比較,形成克隆數(shù)目明顯減少(P0.05)。流式細胞儀檢測細胞周期結果顯示,轉(zhuǎn)染mi R-200a-3p組與NC對照組比較,細胞周期G0/G1發(fā)生阻滯,S期細胞數(shù)降低(P0.05)。細胞凋亡結果顯示,轉(zhuǎn)染mi R-200a-3p組與NC對照組比較,凋亡率明顯增高(P0.01)。Transwell侵襲遷移實驗結果顯示,轉(zhuǎn)染mi R-200a-3p組與NC對照組比較,穿過PET膜的細胞數(shù)明顯減少(P0.05)。動物實驗結果顯示,轉(zhuǎn)染mi R-200a-3p組與NC對照組比較,皮下腫瘤體積明顯減小(P0.01)。3.多個生物信息軟件均預測到mi R-200a-3p種子序列與SPAG9 3'UTR互補結合。雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灲Y果顯示,過表達mi R-200a-3p明顯降低野生型SPAG93'UTR的熒光素酶活性,而對突變型SPAG9 3'UTR無明顯影響。過表達mi R-200a-3p的細胞和mi R-200a-3p干預的裸鼠皮下腫瘤標本中SPAG9明顯下調(diào)。4.相對于人正常腎組織,SPAG9在腎細胞癌組織中的相對表達水平明顯升高,升高幅度約為正常的4倍(P0.001)。相對于人正常腎小管上皮細胞,SPAG9在腎細胞癌細胞系786-O與ACHN細胞中的相對表達水平也明顯升高,升高幅度分別約為正常的4.21倍(P0.01)和6.25倍(P0.01)。免疫組織細胞化學也顯示了相同的結果。5.沉默SPAG9顯著減弱了腎細胞癌細胞的增殖活性(P0.05)、形成克隆數(shù)目(P0.05)、穿過PET膜的細胞數(shù)(P0.05),卻顯著升高凋亡率(P0.01),也使細胞周期G0/G1發(fā)生阻滯,S期細胞數(shù)降低(P0.05),這些作用與過表達mi R-200a-3p相似。而且mi R-200a-3p的作用也可被SPAG9過表達質(zhì)粒所中和。6.Western blot實驗結果顯示,過表達mi R-200a-3p和敲除SPAG9均能抑制腎細胞癌細胞的cyclin D1、bcl-2和MMP9的表達,增強p21和Bax的表達,且過表達mi R-200a-3p的作用可被pc DNA3.1-SPAG9中和。結論:mi R-200a-3p在腎細胞癌中的低表達特征可作為腎細胞癌診斷的腫瘤標志物。mi R-200a-3p在腎細胞癌中作為一個抑癌基因可以顯著抑制腫瘤的增殖、侵襲,促進腫瘤的凋亡。mi R-200a-3p在腎細胞癌中通過靶向調(diào)控SPAG9基因而發(fā)揮抗腫瘤作用。mi R-200a-3p的抑癌作用機制有待于更加深入的研究。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：吉林大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R737.11

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本文編號：1497083