本文關鍵詞：以自組裝多肽RADA16-Ⅰ荷載他莫昔芬和脂肪來源干細胞構建治療性乳房組織

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【摘要】：背景乳腺癌作為惡性腫瘤之一已嚴重影響到女性身心健康,根據(jù)癌癥流行病學每年的調查結果顯示,乳腺癌的發(fā)病率已位居女性癌癥發(fā)病率的第一位。在我國,乳腺癌的發(fā)病率已從30年前的18/10萬上升至30-40/10萬,在如北京、上海、廣州、天津等主要城市,乳腺癌已成為中青年女性中的“頭號殺手”。大部分的乳腺癌患者都會通過接受手術治療來清除腫瘤,但無論是根治性全切除術還是部分乳房切除術,術后都會導致乳房變形以及因術后接受放射治療而導致乳房萎縮。得益于手術、化療、放射治療等多學科治療乳腺癌的進步,患者可以在術后進行乳房重建手術。而實際上,超過90%的女性患者表示會通過接受乳房重建來保持女性之美。目前,乳房重建術基本可分為假體植入、自身肌皮瓣移植以及自體脂肪組織移植三種方式,其中自體脂肪組織移植在近年伴隨抽脂術的成熟而迅速發(fā)展了起來。該方法因其取材容易、創(chuàng)傷小、重建后乳房形態(tài)自然等優(yōu)點而備受關注。但植入的成體脂肪組織在術后會隨著時間的延長而發(fā)生顯著的組織吸收,其體積縮小程度高達40-60%。這是因為植入的脂肪組織血管化程度不佳,導致營養(yǎng)和供氧無法保證,最終影響組織的長期存活。由于自體脂肪組織移植法所特有的局限性,再生醫(yī)學和組織工程研究者開始著眼于尋找新型乳房重建材料以解決植入組織無法長期存活的問題。研究者們需要的這種新型材料必須具備形成微觀三維立體空間支架的能力,可為細胞提供相仿于體內真實生長情況的環(huán)境。而且細胞在此立體培養(yǎng)環(huán)境中,不僅可以存活并增殖,還可以進行分化和表達細胞原有表型。另外,這種新型材料要有良好的生物相容性。只有這樣,具有支架材料和種子細胞的乳房組織才可能用于人體移植以重建乳房。近年來,自組裝多肽作為新興的組織工程支架材料受到了廣泛關注。這種支架材料可以建立起模擬細胞自然生長的環(huán)境,其水凝膠除了擁有能支持細胞的黏附和生長的機械性能外,還有利于細胞之間進行信息交流和物質交換。已有研究發(fā)現(xiàn),自組裝多肽水凝膠可以提供優(yōu)良的微環(huán)境給前體細胞和干細胞進行生長和分化。自組裝多肽是一種蛋白質,具有優(yōu)越的生物相容性,還可以根據(jù)實際應用需要進行設計,打造個體化支架材料,滿足不同的使用需求。另外,由于水凝膠含水量高達99%以上,適用于荷載大部分的藥物或治療性蛋白質。如果需要制備特殊的載藥系統(tǒng),也可以通過修飾多肽來實現(xiàn)。RAD A16-Ⅰ(AcN-RADARADARADARAD A-CNH)是自組裝多肽中的一種,由天然氨基酸組成,在特定條件下可形成大量的納米纖維并進行自組裝,從而構建可注射的自組裝多肽納米纖維水凝膠。自組裝后的RADA16-Ⅰ水凝膠支架的結構與細胞外基質相仿,可以為細胞提供良好的立體培養(yǎng)條件。目前RADA16-Ⅰ已有應用于骨、肌肉、神經、血管再生等范疇的研究報告。要真正解決植入組織長期存活的問題,除了支架材料的選擇外,種子細胞的選擇也不容輕視。干細胞是一類具有自我復制能力的多潛能細胞,它不僅可以增殖,在一定條件下還可以分化成多種功能的細胞。隨著醫(yī)學領域中對干細胞的研究越來越深入,其巨大的應用前景受到了廣大研究者的青睞。相較于其他來源的干細胞,脂肪來源干細胞來源豐富,易于取材,是理想的干細胞提取源。已有大量研究報告指出,脂肪來源干細胞移植可以修復損傷組織的結構以及功能。本論文以新型多肽水凝膠RADA16-Ⅰ支架材料作為細胞三維培養(yǎng)載體,同時荷載抗腫瘤藥物雌激素拮抗劑他莫昔芬,將種子細胞脂肪來源干細胞(ADSCs)接種在三維培養(yǎng)支架上,提供一種新型的用于乳腺癌術后乳房重建術的組織工程復合物材料。目的構建一種新型的細胞三維培養(yǎng)支架復合物,既能與ADSCs組成可注射的適宜乳腺癌術后的乳房修復組織,又可以作為抗癌藥物的緩釋庫提供抗癌藥物殺傷殘余的癌細胞。方法取減重抽脂術患者抽脂所得脂肪,用含青霉素-鏈霉素的磷酸緩沖鹽溶液(PBS)清洗干凈后離心,將脂肪部分分離出來后加入與脂肪等體積的0.15%膠原酶-Ⅰ在37℃條件下至少震蕩消化60分鐘。將消化后的乳糜狀脂肪混懸液離心后,棄去上清及油脂層即可獲得基質血管成分(SVF),其中包含了脂肪來源干細胞及其它可能含有的血細胞及雜質。將基質血管成分(SVF)在完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)三天后即可看見貼壁的脂肪來源干細胞。用含青霉素-鏈霉素的磷酸緩沖鹽溶液(PBS)充分清洗培養(yǎng)瓶內未附著的細胞及其他雜質后,加入完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)至細胞融合率為90%時即可傳代或凍存。所得脂肪來源干細胞通過流式細胞術對其進行表面標志檢測。用含有誘導因子(胰島素,3-異丁基-1-甲基黃嘌呤,地塞米松,吲哚美辛)的成脂化誘導專用培養(yǎng)基對脂肪來源干細胞進行成脂化誘導并用油紅O染色法檢測干細胞分化結果。RADA16-Ⅰ凍干粉用超純水配成0.1%(v/w)溶液,置于37℃環(huán)境過夜使其完成自組裝過程,此法制得的水凝膠支架為空白支架。RADA16-Ⅰ凍干粉用超純水配成0.1%(v/w)溶液,加入抗腫瘤藥物他莫昔芬(25nmol/L),置于37℃環(huán)境過夜完成自組裝過程,此法制得的水凝膠支架為載藥支架。用掃描電鏡法掃描RADA16-Ⅰ水凝膠來觀察其顯微結構。用傅氏轉換紅外線光譜分析法(FTIR)及熱差分析法(DSC)分析空白支架和載藥支架的物理化學性質差異。為分析支架對細胞的影響,將脂肪來源干細胞與乳腺癌MCF-7細胞分別進行平面培養(yǎng)及支架培養(yǎng)。組別共分為四組,分別是平面培養(yǎng)對照組、平面培養(yǎng)給藥組、空白支架培養(yǎng)對照組和載藥支架培養(yǎng)組。加藥組均含有濃度為25μmol/L的抗腫瘤藥物他莫昔芬。各項檢測均在各組細胞分別培養(yǎng)72小時后進行。用MTT法測定加藥組別的藥物抑制率。用流式細胞術測定不同組別細胞的凋亡情況。用蛋白印跡法檢測不同組別細胞相關凋亡蛋白的表達。在裸鼠第二乳房墊進行皮下注射荷載有脂肪來源干細胞(ADSCs)水凝膠支架和荷載他莫昔芬-ADSCs水凝膠支架二種混合物,通過測量植入物體積及裸鼠體重來評測二種混合物植入后的形態(tài)保持情況及植入物對裸鼠體重變化的影響。結果從減重抽脂術患者抽脂后所得脂肪中分離獲得的脂肪來源干細胞可在體外正常增殖,形態(tài)均一,為長梭形成纖維樣細胞,排列具有方向性,呈放射狀或漩渦狀。用流式細胞法測定表面標志結果顯示,干細胞相關表面標志CD90表達為陽性,上皮細胞相關表面標志CD31、血管內皮細胞相關抗原CD34、造血細胞相關抗原CD45表達均為陰性。脂肪來源干細胞經過成脂誘導后,顯微鏡下觀察細胞呈圓形或橢圓形,細胞質內可以觀察到大量大小不等、折光性很強的脂滴,經過油紅O染色后,細胞質內脂滴呈橙紅色。經過體外實驗對載藥濃度進行篩選,在他莫昔芬濃度為25μmol/L時可在較大程度上抑制乳腺癌MCF-7細胞但未超過他莫昔芬對ADSCs的半數(shù)致死量。將藥物荷載于RADA16-Ⅰ水凝膠支架上后,用掃描電鏡法觀察空白水凝膠支架和載藥水凝膠支架可見,空白水凝膠表面可見網(wǎng)孔狀結構,表面平滑可供細胞附著。載藥支架雖然加入了藥物,但他莫昔芬并未對支架的該特征產生影響。用傅氏轉換紅外線光譜分析法分析空白支架和載藥支架,兩種支架均可檢測出O-H伸縮振動峰、C=N伸縮振動峰、C-N伸縮振動峰以及N-H伸縮振動峰,但載藥支架受加入的抗腫瘤藥物他莫昔芬影響,檢測到C=N伸縮振動峰增強。熱差分析法檢測結果顯示加入藥物對RADA16-Ⅰ的物理性質未有重大影響。用MTT法測定藥物抑制率,在乳腺癌MCF-7細胞中,載藥支架培養(yǎng)組的抑制率為81.86%±2.8%,與平面培養(yǎng)給藥組的抑制率(80.25%±2.5%)相比無顯著性差異(P0.05)；在脂肪來源干細胞中,載藥支架培養(yǎng)組的抑制率為25.36%±2.1%,與平面培養(yǎng)給藥組(44.76%±4.4%)相比顯著降低(P0.05)。用流式細胞術測定乳腺癌MCF-7細胞及脂肪來源干細胞在各個組別中的凋亡情況,在乳腺癌MCF-7細胞中,平面培養(yǎng)對照組的凋亡率為10.9%,平面培養(yǎng)給藥組為27.4%,空白支架培養(yǎng)對照組為10.2%,載藥支架培養(yǎng)組為54.6%,載藥支架培養(yǎng)組的凋亡率顯著高于平面培養(yǎng)給藥組P0.05)；在脂肪來源干細胞中,平面培養(yǎng)對照組的凋亡率為0.7%,平面培養(yǎng)給藥組為10.8%,空白支架培養(yǎng)對照組的凋亡率為0.8%,載藥支架培養(yǎng)組的凋亡率為4.3%,載藥支架培養(yǎng)組的凋亡率比平面培養(yǎng)給藥組降低。用蛋白印跡法提取各組別細胞的蛋白質分析其凋亡蛋白的表達變化。在脂肪來源干細胞中,B細胞淋巴瘤/白血病-2基因(BCL-2)在平面培養(yǎng)對照組和平面培養(yǎng)給藥組間存在表達差異(P0.05),但空白支架培養(yǎng)對照組和載藥支架培養(yǎng)組中的表達無顯著性差異(P0.05)。在乳腺癌MCF-7細胞中,Bcl-2在平面培養(yǎng)給藥組以及載藥支架培養(yǎng)組中的表達均顯著低于相對應的對照組(P0.05),但平面培養(yǎng)給藥組和載藥支架培養(yǎng)組間蛋白的表達情況并無顯著性差異(P0.05)。在裸鼠第二乳房墊皮下注射荷載有脂肪來源干細胞(ADSCs)的水凝膠支架或載藥水凝膠支架混合物后觀察。兩種植入物在裸鼠皮下均可形成一個圓形的包塊,形狀規(guī)則、邊緣清晰、輕輕按壓后不變形,形態(tài)維持時間最長為7天。與含有抗腫瘤藥物他莫昔芬的支架-ADSCs復合物相比,支架-ADSCs復合物在植入后能維持較好的形態(tài)。ADSCs與兩種支架混合植入對裸鼠體重變化影響不大,兩者無顯著性差異,提示藥物的加入并未影響裸鼠的正常生長。結論綜上,以RADA16-Ⅰ多肽水凝膠作為支架材料,荷載抗腫瘤藥物他莫昔芬和脂肪來源干細胞,RADA16-Ⅰ可以保護脂肪來源干細胞,有效減少抗腫瘤藥物他莫昔芬對細胞帶來的損傷,但RADA16-Ⅰ不會影響抗腫瘤藥物他莫昔芬對乳腺癌MCF-7細胞的殺傷作用,并推測RADA16-Ⅰ可以促進抗腫瘤藥物他莫昔芬對乳腺癌MCF-7細胞的晚期凋亡。體內實驗亦提示以RADA16-Ⅰ作為支架材料,荷載抗腫瘤藥物他莫昔芬和脂肪來源干細胞在體外構建治療性乳房組織具有一定的可行性。但在如何延長體內維持形態(tài)的時間方面還需作進一步探索。
【關鍵詞】：自組裝多肽 RADA16-Ⅰ 脂肪來源干細胞 組織工程
【學位授予單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R737.9
【目錄】：

• 摘要3-9
• ABSTRACT9-17
• 前言17-21
• 第一章 脂肪來源干細胞的分離及鑒定21-30
• 1 脂肪來源干細胞的分離21-25
• 1.1 材料21-22
• 1.2 實驗方法22-25
• 2 脂肪來源干細胞的鑒定25-29
• 2.1 流式細胞術檢測細胞表面標志鑒定脂肪來源干細胞25-26
• 2.2 成脂化誘導法鑒定脂肪來源干細胞26-29
• 3 本章小結29-30
• 第二章 體外細胞實驗篩選抗腫瘤藥物他莫昔芬的濃度30-37
• 1 他莫昔芬對乳腺癌細胞MCF-7的增殖抑制30-33
• 1.1 材料30-31
• 1.2 實驗方法31-32
• 1.3 結果32-33
• 2 不同濃度他莫昔芬對脂肪來源干細胞(ADSCs)的增殖抑制33-36
• 2.1 材料33
• 2.2 實驗方法33-34
• 2.3 結果34-36
• 3 本章小結36-37
• 第三章 RADA16-Ⅰ多肽水凝膠支架的制備與理化性質分析37-44
• 1 RADA16-Ⅰ多肽水凝膠支架的制備37-43
• 1.1 材料37-38
• 1.2 實驗方法38-40
• 1.3 結果40-43
• 2 本章小結43-44
• 第四章 多肽支架培養(yǎng)對脂肪來源干細胞的影響44-55
• 1 多肽支架培養(yǎng)對脂肪來源干細胞增殖的影響44-47
• 1.1 材料44
• 1.2 實驗方法44-46
• 1.3 結果46-47
• 2 多肽支架培養(yǎng)對脂肪來源干細胞凋亡的影響47-53
• 2.1 多肽支架培養(yǎng)對脂肪來源干細胞凋亡率的影響47-49
• 2.2 多肽支架培養(yǎng)對脂肪來源干細胞凋亡相關蛋白表達的影響49-53
• 3 本章小結53-55
• 第五章 多肽支架培養(yǎng)對乳腺癌MCF-7細胞的影響55-60
• 1 多肽支架培養(yǎng)對乳腺癌MCF-7細胞增殖的影響55-57
• 1.1 材料55
• 1.2 實驗方法55-56
• 1.3 結果56-57
• 2 多肽支架培養(yǎng)對乳腺癌MCF-7細胞凋亡的影響57-59
• 2.1 多肽支架培養(yǎng)對乳腺癌MCF-7細胞凋亡率的影響57
• 2.2 多肽支架培養(yǎng)對乳腺癌MCF-7細胞凋亡相關蛋白表達的影響57-59
• 3 本章小結59-60
• 第六章 多肽水凝膠支架體內植入效果初探60-67
• 1 ADSCs與兩種支架材料的復合培養(yǎng)60-66
• 1.1 材料60-61
• 1.2 實驗方法61-62
• 1.3 結果62-66
• 2 本章小結66-67
• 第七章 全文總結67-69
• 參考文獻69-75
• 成果75-76
• 縮寫詞中英文對照表(ABBREVIATION)76-77
• 致謝77-79

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1 趙建輝;易成剛;郭樹忠;;脂肪來源干細胞的基礎研究進展[J];中國美容醫(yī)學;2011年03期

2 李萍;田方;宋琦;劉煥霞;李孟芳;魏丹;;新生牛血清對大鼠脂肪來源細胞生長的影響[J];遵義醫(yī)學院學報;2011年04期

3 徐小春;李光早;;脂肪來源干細胞的基礎研究及成脂應用進展[J];中華全科醫(yī)學;2012年05期

4 趙s罹，

本文編號：1041423