發(fā)布時(shí)間：2017-10-16 07:39

  本文關(guān)鍵詞：以自組裝多肽RADA16-Ⅰ荷載他莫昔芬和脂肪來源干細(xì)胞構(gòu)建治療性乳房組織

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【摘要】：背景乳腺癌作為惡性腫瘤之一已嚴(yán)重影響到女性身心健康,根據(jù)癌癥流行病學(xué)每年的調(diào)查結(jié)果顯示,乳腺癌的發(fā)病率已位居女性癌癥發(fā)病率的第一位。在我國,乳腺癌的發(fā)病率已從30年前的18/10萬上升至30-40/10萬,在如北京、上海、廣州、天津等主要城市,乳腺癌已成為中青年女性中的“頭號(hào)殺手”。大部分的乳腺癌患者都會(huì)通過接受手術(shù)治療來清除腫瘤,但無論是根治性全切除術(shù)還是部分乳房切除術(shù),術(shù)后都會(huì)導(dǎo)致乳房變形以及因術(shù)后接受放射治療而導(dǎo)致乳房萎縮。得益于手術(shù)、化療、放射治療等多學(xué)科治療乳腺癌的進(jìn)步,患者可以在術(shù)后進(jìn)行乳房重建手術(shù)。而實(shí)際上,超過90%的女性患者表示會(huì)通過接受乳房重建來保持女性之美。目前,乳房重建術(shù)基本可分為假體植入、自身肌皮瓣移植以及自體脂肪組織移植三種方式,其中自體脂肪組織移植在近年伴隨抽脂術(shù)的成熟而迅速發(fā)展了起來。該方法因其取材容易、創(chuàng)傷小、重建后乳房形態(tài)自然等優(yōu)點(diǎn)而備受關(guān)注。但植入的成體脂肪組織在術(shù)后會(huì)隨著時(shí)間的延長而發(fā)生顯著的組織吸收,其體積縮小程度高達(dá)40-60%。這是因?yàn)橹踩氲闹窘M織血管化程度不佳,導(dǎo)致營養(yǎng)和供氧無法保證,最終影響組織的長期存活。由于自體脂肪組織移植法所特有的局限性,再生醫(yī)學(xué)和組織工程研究者開始著眼于尋找新型乳房重建材料以解決植入組織無法長期存活的問題。研究者們需要的這種新型材料必須具備形成微觀三維立體空間支架的能力,可為細(xì)胞提供相仿于體內(nèi)真實(shí)生長情況的環(huán)境。而且細(xì)胞在此立體培養(yǎng)環(huán)境中,不僅可以存活并增殖,還可以進(jìn)行分化和表達(dá)細(xì)胞原有表型。另外,這種新型材料要有良好的生物相容性。只有這樣,具有支架材料和種子細(xì)胞的乳房組織才可能用于人體移植以重建乳房。近年來,自組裝多肽作為新興的組織工程支架材料受到了廣泛關(guān)注。這種支架材料可以建立起模擬細(xì)胞自然生長的環(huán)境,其水凝膠除了擁有能支持細(xì)胞的黏附和生長的機(jī)械性能外,還有利于細(xì)胞之間進(jìn)行信息交流和物質(zhì)交換。已有研究發(fā)現(xiàn),自組裝多肽水凝膠可以提供優(yōu)良的微環(huán)境給前體細(xì)胞和干細(xì)胞進(jìn)行生長和分化。自組裝多肽是一種蛋白質(zhì),具有優(yōu)越的生物相容性,還可以根據(jù)實(shí)際應(yīng)用需要進(jìn)行設(shè)計(jì),打造個(gè)體化支架材料,滿足不同的使用需求。另外,由于水凝膠含水量高達(dá)99%以上,適用于荷載大部分的藥物或治療性蛋白質(zhì)。如果需要制備特殊的載藥系統(tǒng),也可以通過修飾多肽來實(shí)現(xiàn)。RAD A16-Ⅰ(AcN-RADARADARADARAD A-CNH)是自組裝多肽中的一種,由天然氨基酸組成,在特定條件下可形成大量的納米纖維并進(jìn)行自組裝,從而構(gòu)建可注射的自組裝多肽納米纖維水凝膠。自組裝后的RADA16-Ⅰ水凝膠支架的結(jié)構(gòu)與細(xì)胞外基質(zhì)相仿,可以為細(xì)胞提供良好的立體培養(yǎng)條件。目前RADA16-Ⅰ已有應(yīng)用于骨、肌肉、神經(jīng)、血管再生等范疇的研究報(bào)告。要真正解決植入組織長期存活的問題,除了支架材料的選擇外,種子細(xì)胞的選擇也不容輕視。干細(xì)胞是一類具有自我復(fù)制能力的多潛能細(xì)胞,它不僅可以增殖,在一定條件下還可以分化成多種功能的細(xì)胞。隨著醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中對(duì)干細(xì)胞的研究越來越深入,其巨大的應(yīng)用前景受到了廣大研究者的青睞。相較于其他來源的干細(xì)胞,脂肪來源干細(xì)胞來源豐富,易于取材,是理想的干細(xì)胞提取源。已有大量研究報(bào)告指出,脂肪來源干細(xì)胞移植可以修復(fù)損傷組織的結(jié)構(gòu)以及功能。本論文以新型多肽水凝膠RADA16-Ⅰ支架材料作為細(xì)胞三維培養(yǎng)載體,同時(shí)荷載抗腫瘤藥物雌激素拮抗劑他莫昔芬,將種子細(xì)胞脂肪來源干細(xì)胞(ADSCs)接種在三維培養(yǎng)支架上,提供一種新型的用于乳腺癌術(shù)后乳房重建術(shù)的組織工程復(fù)合物材料。目的構(gòu)建一種新型的細(xì)胞三維培養(yǎng)支架復(fù)合物,既能與ADSCs組成可注射的適宜乳腺癌術(shù)后的乳房修復(fù)組織,又可以作為抗癌藥物的緩釋庫提供抗癌藥物殺傷殘余的癌細(xì)胞。方法取減重抽脂術(shù)患者抽脂所得脂肪,用含青霉素-鏈霉素的磷酸緩沖鹽溶液(PBS)清洗干凈后離心,將脂肪部分分離出來后加入與脂肪等體積的0.15%膠原酶-Ⅰ在37℃條件下至少震蕩消化60分鐘。將消化后的乳糜狀脂肪混懸液離心后,棄去上清及油脂層即可獲得基質(zhì)血管成分(SVF),其中包含了脂肪來源干細(xì)胞及其它可能含有的血細(xì)胞及雜質(zhì)。將基質(zhì)血管成分(SVF)在完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)三天后即可看見貼壁的脂肪來源干細(xì)胞。用含青霉素-鏈霉素的磷酸緩沖鹽溶液(PBS)充分清洗培養(yǎng)瓶內(nèi)未附著的細(xì)胞及其他雜質(zhì)后,加入完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)至細(xì)胞融合率為90%時(shí)即可傳代或凍存。所得脂肪來源干細(xì)胞通過流式細(xì)胞術(shù)對(duì)其進(jìn)行表面標(biāo)志檢測。用含有誘導(dǎo)因子(胰島素,3-異丁基-1-甲基黃嘌呤,地塞米松,吲哚美辛)的成脂化誘導(dǎo)專用培養(yǎng)基對(duì)脂肪來源干細(xì)胞進(jìn)行成脂化誘導(dǎo)并用油紅O染色法檢測干細(xì)胞分化結(jié)果。RADA16-Ⅰ凍干粉用超純水配成0.1%(v/w)溶液,置于37℃環(huán)境過夜使其完成自組裝過程,此法制得的水凝膠支架為空白支架。RADA16-Ⅰ凍干粉用超純水配成0.1%(v/w)溶液,加入抗腫瘤藥物他莫昔芬(25nmol/L),置于37℃環(huán)境過夜完成自組裝過程,此法制得的水凝膠支架為載藥支架。用掃描電鏡法掃描RADA16-Ⅰ水凝膠來觀察其顯微結(jié)構(gòu)。用傅氏轉(zhuǎn)換紅外線光譜分析法(FTIR)及熱差分析法(DSC)分析空白支架和載藥支架的物理化學(xué)性質(zhì)差異。為分析支架對(duì)細(xì)胞的影響,將脂肪來源干細(xì)胞與乳腺癌MCF-7細(xì)胞分別進(jìn)行平面培養(yǎng)及支架培養(yǎng)。組別共分為四組,分別是平面培養(yǎng)對(duì)照組、平面培養(yǎng)給藥組、空白支架培養(yǎng)對(duì)照組和載藥支架培養(yǎng)組。加藥組均含有濃度為25μmol/L的抗腫瘤藥物他莫昔芬。各項(xiàng)檢測均在各組細(xì)胞分別培養(yǎng)72小時(shí)后進(jìn)行。用MTT法測定加藥組別的藥物抑制率。用流式細(xì)胞術(shù)測定不同組別細(xì)胞的凋亡情況。用蛋白印跡法檢測不同組別細(xì)胞相關(guān)凋亡蛋白的表達(dá)。在裸鼠第二乳房墊進(jìn)行皮下注射荷載有脂肪來源干細(xì)胞(ADSCs)水凝膠支架和荷載他莫昔芬-ADSCs水凝膠支架二種混合物,通過測量植入物體積及裸鼠體重來評(píng)測二種混合物植入后的形態(tài)保持情況及植入物對(duì)裸鼠體重變化的影響。結(jié)果從減重抽脂術(shù)患者抽脂后所得脂肪中分離獲得的脂肪來源干細(xì)胞可在體外正常增殖,形態(tài)均一,為長梭形成纖維樣細(xì)胞,排列具有方向性,呈放射狀或漩渦狀。用流式細(xì)胞法測定表面標(biāo)志結(jié)果顯示,干細(xì)胞相關(guān)表面標(biāo)志CD90表達(dá)為陽性,上皮細(xì)胞相關(guān)表面標(biāo)志CD31、血管內(nèi)皮細(xì)胞相關(guān)抗原CD34、造血細(xì)胞相關(guān)抗原CD45表達(dá)均為陰性。脂肪來源干細(xì)胞經(jīng)過成脂誘導(dǎo)后,顯微鏡下觀察細(xì)胞呈圓形或橢圓形,細(xì)胞質(zhì)內(nèi)可以觀察到大量大小不等、折光性很強(qiáng)的脂滴,經(jīng)過油紅O染色后,細(xì)胞質(zhì)內(nèi)脂滴呈橙紅色。經(jīng)過體外實(shí)驗(yàn)對(duì)載藥濃度進(jìn)行篩選,在他莫昔芬濃度為25μmol/L時(shí)可在較大程度上抑制乳腺癌MCF-7細(xì)胞但未超過他莫昔芬對(duì)ADSCs的半數(shù)致死量。將藥物荷載于RADA16-Ⅰ水凝膠支架上后,用掃描電鏡法觀察空白水凝膠支架和載藥水凝膠支架可見,空白水凝膠表面可見網(wǎng)孔狀結(jié)構(gòu),表面平滑可供細(xì)胞附著。載藥支架雖然加入了藥物,但他莫昔芬并未對(duì)支架的該特征產(chǎn)生影響。用傅氏轉(zhuǎn)換紅外線光譜分析法分析空白支架和載藥支架,兩種支架均可檢測出O-H伸縮振動(dòng)峰、C=N伸縮振動(dòng)峰、C-N伸縮振動(dòng)峰以及N-H伸縮振動(dòng)峰,但載藥支架受加入的抗腫瘤藥物他莫昔芬影響,檢測到C=N伸縮振動(dòng)峰增強(qiáng)。熱差分析法檢測結(jié)果顯示加入藥物對(duì)RADA16-Ⅰ的物理性質(zhì)未有重大影響。用MTT法測定藥物抑制率,在乳腺癌MCF-7細(xì)胞中,載藥支架培養(yǎng)組的抑制率為81.86%±2.8%,與平面培養(yǎng)給藥組的抑制率(80.25%±2.5%)相比無顯著性差異(P0.05)；在脂肪來源干細(xì)胞中,載藥支架培養(yǎng)組的抑制率為25.36%±2.1%,與平面培養(yǎng)給藥組(44.76%±4.4%)相比顯著降低(P0.05)。用流式細(xì)胞術(shù)測定乳腺癌MCF-7細(xì)胞及脂肪來源干細(xì)胞在各個(gè)組別中的凋亡情況,在乳腺癌MCF-7細(xì)胞中,平面培養(yǎng)對(duì)照組的凋亡率為10.9%,平面培養(yǎng)給藥組為27.4%,空白支架培養(yǎng)對(duì)照組為10.2%,載藥支架培養(yǎng)組為54.6%,載藥支架培養(yǎng)組的凋亡率顯著高于平面培養(yǎng)給藥組P0.05)；在脂肪來源干細(xì)胞中,平面培養(yǎng)對(duì)照組的凋亡率為0.7%,平面培養(yǎng)給藥組為10.8%,空白支架培養(yǎng)對(duì)照組的凋亡率為0.8%,載藥支架培養(yǎng)組的凋亡率為4.3%,載藥支架培養(yǎng)組的凋亡率比平面培養(yǎng)給藥組降低。用蛋白印跡法提取各組別細(xì)胞的蛋白質(zhì)分析其凋亡蛋白的表達(dá)變化。在脂肪來源干細(xì)胞中,B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2基因(BCL-2)在平面培養(yǎng)對(duì)照組和平面培養(yǎng)給藥組間存在表達(dá)差異(P0.05),但空白支架培養(yǎng)對(duì)照組和載藥支架培養(yǎng)組中的表達(dá)無顯著性差異(P0.05)。在乳腺癌MCF-7細(xì)胞中,Bcl-2在平面培養(yǎng)給藥組以及載藥支架培養(yǎng)組中的表達(dá)均顯著低于相對(duì)應(yīng)的對(duì)照組(P0.05),但平面培養(yǎng)給藥組和載藥支架培養(yǎng)組間蛋白的表達(dá)情況并無顯著性差異(P0.05)。在裸鼠第二乳房墊皮下注射荷載有脂肪來源干細(xì)胞(ADSCs)的水凝膠支架或載藥水凝膠支架混合物后觀察。兩種植入物在裸鼠皮下均可形成一個(gè)圓形的包塊,形狀規(guī)則、邊緣清晰、輕輕按壓后不變形,形態(tài)維持時(shí)間最長為7天。與含有抗腫瘤藥物他莫昔芬的支架-ADSCs復(fù)合物相比,支架-ADSCs復(fù)合物在植入后能維持較好的形態(tài)。ADSCs與兩種支架混合植入對(duì)裸鼠體重變化影響不大,兩者無顯著性差異,提示藥物的加入并未影響裸鼠的正常生長。結(jié)論綜上,以RADA16-Ⅰ多肽水凝膠作為支架材料,荷載抗腫瘤藥物他莫昔芬和脂肪來源干細(xì)胞,RADA16-Ⅰ可以保護(hù)脂肪來源干細(xì)胞,有效減少抗腫瘤藥物他莫昔芬對(duì)細(xì)胞帶來的損傷,但RADA16-Ⅰ不會(huì)影響抗腫瘤藥物他莫昔芬對(duì)乳腺癌MCF-7細(xì)胞的殺傷作用,并推測RADA16-Ⅰ可以促進(jìn)抗腫瘤藥物他莫昔芬對(duì)乳腺癌MCF-7細(xì)胞的晚期凋亡。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)亦提示以RADA16-Ⅰ作為支架材料,荷載抗腫瘤藥物他莫昔芬和脂肪來源干細(xì)胞在體外構(gòu)建治療性乳房組織具有一定的可行性。但在如何延長體內(nèi)維持形態(tài)的時(shí)間方面還需作進(jìn)一步探索。
【關(guān)鍵詞】：自組裝多肽 RADA16-Ⅰ 脂肪來源干細(xì)胞 組織工程
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R737.9
【目錄】：

• 摘要3-9
• ABSTRACT9-17
• 前言17-21
• 第一章 脂肪來源干細(xì)胞的分離及鑒定21-30
• 1 脂肪來源干細(xì)胞的分離21-25
• 1.1 材料21-22
• 1.2 實(shí)驗(yàn)方法22-25
• 2 脂肪來源干細(xì)胞的鑒定25-29
• 2.1 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞表面標(biāo)志鑒定脂肪來源干細(xì)胞25-26
• 2.2 成脂化誘導(dǎo)法鑒定脂肪來源干細(xì)胞26-29
• 3 本章小結(jié)29-30
• 第二章 體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)篩選抗腫瘤藥物他莫昔芬的濃度30-37
• 1 他莫昔芬對(duì)乳腺癌細(xì)胞MCF-7的增殖抑制30-33
• 1.1 材料30-31
• 1.2 實(shí)驗(yàn)方法31-32
• 1.3 結(jié)果32-33
• 2 不同濃度他莫昔芬對(duì)脂肪來源干細(xì)胞(ADSCs)的增殖抑制33-36
• 2.1 材料33
• 2.2 實(shí)驗(yàn)方法33-34
• 2.3 結(jié)果34-36
• 3 本章小結(jié)36-37
• 第三章 RADA16-Ⅰ多肽水凝膠支架的制備與理化性質(zhì)分析37-44
• 1 RADA16-Ⅰ多肽水凝膠支架的制備37-43
• 1.1 材料37-38
• 1.2 實(shí)驗(yàn)方法38-40
• 1.3 結(jié)果40-43
• 2 本章小結(jié)43-44
• 第四章 多肽支架培養(yǎng)對(duì)脂肪來源干細(xì)胞的影響44-55
• 1 多肽支架培養(yǎng)對(duì)脂肪來源干細(xì)胞增殖的影響44-47
• 1.1 材料44
• 1.2 實(shí)驗(yàn)方法44-46
• 1.3 結(jié)果46-47
• 2 多肽支架培養(yǎng)對(duì)脂肪來源干細(xì)胞凋亡的影響47-53
• 2.1 多肽支架培養(yǎng)對(duì)脂肪來源干細(xì)胞凋亡率的影響47-49
• 2.2 多肽支架培養(yǎng)對(duì)脂肪來源干細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響49-53
• 3 本章小結(jié)53-55
• 第五章 多肽支架培養(yǎng)對(duì)乳腺癌MCF-7細(xì)胞的影響55-60
• 1 多肽支架培養(yǎng)對(duì)乳腺癌MCF-7細(xì)胞增殖的影響55-57
• 1.1 材料55
• 1.2 實(shí)驗(yàn)方法55-56
• 1.3 結(jié)果56-57
• 2 多肽支架培養(yǎng)對(duì)乳腺癌MCF-7細(xì)胞凋亡的影響57-59
• 2.1 多肽支架培養(yǎng)對(duì)乳腺癌MCF-7細(xì)胞凋亡率的影響57
• 2.2 多肽支架培養(yǎng)對(duì)乳腺癌MCF-7細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響57-59
• 3 本章小結(jié)59-60
• 第六章 多肽水凝膠支架體內(nèi)植入效果初探60-67
• 1 ADSCs與兩種支架材料的復(fù)合培養(yǎng)60-66
• 1.1 材料60-61
• 1.2 實(shí)驗(yàn)方法61-62
• 1.3 結(jié)果62-66
• 2 本章小結(jié)66-67
• 第七章 全文總結(jié)67-69
• 參考文獻(xiàn)69-75
• 成果75-76
• 縮寫詞中英文對(duì)照表(ABBREVIATION)76-77
• 致謝77-79

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1 趙建輝;易成剛;郭樹忠;;脂肪來源干細(xì)胞的基礎(chǔ)研究進(jìn)展[J];中國美容醫(yī)學(xué);2011年03期

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3 徐小春;李光早;;脂肪來源干細(xì)胞的基礎(chǔ)研究及成脂應(yīng)用進(jìn)展[J];中華全科醫(yī)學(xué);2012年05期

4 趙s罹，

本文編號(hào)：1041423