本文關(guān)鍵詞：重組蕎麥胰蛋白酶抑制劑對乳腺癌細(xì)胞MCF-7作用的研究

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【摘要】：乳腺癌作為一種高發(fā)性腫瘤,它的預(yù)防和治療在生物界和醫(yī)學(xué)界越來越受到重視,尋求一種新型有效且低毒性的抗乳腺癌藥物迫在眉睫。近年來植物來源的胰蛋白酶抑制劑預(yù)防和抵制癌癥的功能已成為一個(gè)熱點(diǎn)受到特別關(guān)注。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)：來自蕎麥中的重組胰蛋白酶抑制劑rBTI(recombinant buckwheat trypsin inhibitor)可以抑制人類白血病細(xì)胞(K562,HL60)以及人類實(shí)體瘤細(xì)胞HepG2, EC9706 等的增殖,并促進(jìn)細(xì)胞凋亡。但rBTI抑制腫瘤細(xì)胞增殖以及其促進(jìn)細(xì)胞凋亡的機(jī)制和分子靶點(diǎn)還尚不明確。研究發(fā)現(xiàn),NFKB/p65信號通路在乳腺癌細(xì)胞的產(chǎn)生和發(fā)展中起著較為關(guān)鍵的作用。為了探究重組蕎麥胰蛋白酶抑制劑rBTI對人乳腺癌細(xì)胞MCF-7的作用及其機(jī)制,本研究主要開展以下研究內(nèi)容：1、采用MTT法進(jìn)行檢測,發(fā)現(xiàn)rBTI能夠明顯的抑制人乳腺癌MCF-7細(xì)胞的增殖,并呈現(xiàn)出一種劑量依賴的方式。劃痕愈傷實(shí)驗(yàn)表明rBTI可抑制MCF-7細(xì)胞遷移。用不同濃度的rBTI對MCF-7細(xì)胞進(jìn)行處理后,通過流式細(xì)胞術(shù)對MCF-7細(xì)胞周期和凋亡情況進(jìn)行檢測,發(fā)現(xiàn)細(xì)胞周期進(jìn)程受到阻滯并出現(xiàn)明顯的凋亡現(xiàn)象。qRT-PCR和Western Blot檢測周期相關(guān)因子p53、CDK1、CDK2及細(xì)胞凋亡相關(guān)因子Fas、Bax、Bc1-2在mRNA水平和蛋白水平的表達(dá)量,發(fā)現(xiàn)促凋亡基因顯著表達(dá),而抑凋亡基因表達(dá)量明顯減少。2、不同濃度的rBTI對MCF-7細(xì)胞進(jìn)行處理后,運(yùn)用Western Blot技術(shù)和qRT-PCR對NFκB/p65途徑中p65、IκBα、IKKα/β在轉(zhuǎn)錄水平、翻譯水平的表達(dá)量進(jìn)行檢測；通過免疫熒光技術(shù)檢測p65的核轉(zhuǎn)位,結(jié)果顯示IKKa/p表達(dá)量顯著升高、IκBα發(fā)生了明顯的磷酸化,同時(shí)p65蛋白在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)逐漸減少、在細(xì)胞核內(nèi)逐漸增多。流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果表明rBTI可促使ROS水平升高,當(dāng)NAC將ROS抑制后,可從Western blot結(jié)果看出IκBα的磷酸化情況明顯減小,NF-KB/p65核轉(zhuǎn)位也相對減少。說明NF-KB/p65信號通路的激活與ROS的增加相關(guān)。由此可見,rBTⅠ可促進(jìn)ROS的產(chǎn)生,IκBα的磷酸化降解,從而誘導(dǎo)p65蛋白的核轉(zhuǎn)位,激活NF-κB/P65信號通路。綜上所述,rBTI阻斷MCF-7細(xì)胞周期進(jìn)程,促進(jìn)MCF-7細(xì)胞凋亡,可能是通過激活MCF-7細(xì)胞中NFKB/p65信號通路。3、rBTI和紫杉醇都具有抑制腫瘤細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡等作用,但兩者聯(lián)合用藥對腫瘤細(xì)胞的影響尚不明確。本研究通過MTT比色法對rBTI與紫杉醇聯(lián)合用藥對MCF-7細(xì)胞增殖的影響進(jìn)行檢測；采用流式細(xì)胞術(shù)對MCF-7細(xì)胞的凋亡以及ROS水平進(jìn)行檢測；利用qRT-PCR和Western印跡方法,檢測rBTI與紫杉醇聯(lián)合作用后凋亡因子表達(dá)情況。結(jié)果表明,rBTI(2.5μM)與紫杉醇(0.05-0.5μM)聯(lián)合作用于MCF-7細(xì)胞后,能顯著抑制其增殖。將rBTI與紫杉醇進(jìn)行聯(lián)合作用于MCF-7細(xì)胞,誘導(dǎo)了MCF-7細(xì)胞的凋亡及ROS的產(chǎn)生；同時(shí)與rBTI單獨(dú)作用時(shí)相比,聯(lián)合作用明顯上調(diào)了p53、Bax的表達(dá),促進(jìn)了IκBα蛋白的磷酸化以及NFκB/P65的核轉(zhuǎn)位；與rBTI組和紫杉醇單獨(dú)作用組相比,兩者聯(lián)合用藥明顯下調(diào)了Bcl-2和Cyclin D1的表達(dá)。本研究證實(shí),rBTI聯(lián)合紫杉醇可誘導(dǎo)ROS的產(chǎn)生,激活NFκB/P65信號通路,協(xié)同誘導(dǎo)MCF-7細(xì)胞的凋亡。以上研究結(jié)果為rBTI抗乳腺癌作用的研究奠定了基礎(chǔ),為乳腺癌的治療和聯(lián)合用藥提供了新的策略。
【關(guān)鍵詞】：重組蕎麥胰蛋白酶抑制劑 凋亡 活性氧 MCF-7細(xì)胞 核轉(zhuǎn)錄因子-κB
【學(xué)位授予單位】：山西大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R737.9
【目錄】：

• 中文摘要10-12
• ABSTRACT12-14
• 第一章 文獻(xiàn)綜述14-19
• 1.1 引言14
• 1.2 蛋白酶抑制劑14-15
• 1.2.1 蛋白酶抑制劑的結(jié)構(gòu)與分類14
• 1.2.2 蛋白酶抑制劑的生物學(xué)功能14-15
• 1.3 NFκB信號通路研究進(jìn)展15-18
• 1.3.1 NFκB信號通路概述15-18
• 1.3.2 NFκB信號通路在腫瘤細(xì)胞中的功能研究18
• 1.4 本論文的研究目的與意義18-19
• 第二章 rBTI對MCF-7細(xì)胞的作用研究19-30
• 2.1 引言19
• 2.2 實(shí)驗(yàn)材料與儀器19-20
• 2.2.1 細(xì)胞、材料及主要試劑19
• 2.2.2 主要實(shí)驗(yàn)儀器19-20
• 2.3 實(shí)驗(yàn)方法20-23
• 2.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)20
• 2.3.2 MTT檢測20-21
• 2.3.3 細(xì)胞周期檢測21
• 2.3.4 細(xì)胞凋亡檢測21
• 2.3.5 細(xì)胞線粒體膜電位檢測(MMP,△Ψm)21
• 2.3.6 劃痕擦傷實(shí)驗(yàn)檢測MCF-7細(xì)胞遷移21-22
• 2.3.7 RNA的提取及cDNA的合成22
• 2.3.8 qRT-PCR檢測基因的表達(dá)情況22
• 2.3.9 Western blot檢測蛋白表達(dá)量22-23
• 2.3.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析23
• 2.4 結(jié)果與分析23-28
• 2.4.1 rBTI可抑制MCF-7細(xì)胞的增殖23-24
• 2.4.2 rBTI可阻斷MCF-7細(xì)胞的細(xì)胞周期24-25
• 2.4.3 rBTI可誘導(dǎo)MCF-7細(xì)胞凋亡25-26
• 2.4.4 rBTI可降低MCF-7細(xì)胞的線粒體膜電位26
• 2.4.5 rBTI可抑制MCF-7細(xì)胞遷移26-27
• 2.4.6 rBTI對細(xì)胞周期及凋亡基因表達(dá)的影響27-28
• 2.4.7 rBTI對細(xì)胞周期及凋亡蛋白表達(dá)的影響28
• 2.5 小結(jié)28-30
• 第三章 rBTI對MCF-7細(xì)胞NFKB信號通路的影響30-39
• 3.1 引言30
• 3.2 實(shí)驗(yàn)材料與儀器30-31
• 3.2.1 細(xì)胞、材料及主要試劑30
• 3.2.2 主要實(shí)驗(yàn)儀器30-31
• 3.3 實(shí)驗(yàn)方法31-32
• 3.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)31
• 3.3.2 RNA的提取及cDNA的合成31
• 3.3.3 qRT-PCR檢測細(xì)胞IKKα/β、IκBα基因表達(dá)31
• 3.3.4 Western blot檢測蛋白的表達(dá)量31
• 3.3.5 熒光免疫技術(shù)檢測NF-κB/p65蛋白的核轉(zhuǎn)位31-32
• 3.3.6 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞ROS水平32
• 3.3.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析32
• 3.4 結(jié)果與分析32-37
• 3.4.1 rBTI對NF-κB/p65蛋白在MCF-7細(xì)胞中分布的影響32
• 3.4.2 rBTI對NF-κB/p65蛋白核轉(zhuǎn)位的影響32-35
• 3.4.3 rBTI下調(diào)IκBα的表達(dá)35
• 3.4.4 rBTI誘導(dǎo)MCF-7細(xì)胞中ROS的產(chǎn)生35-37
• 3.5 小結(jié)37-39
• 第四章 rBTI聯(lián)合紫杉醇對MCF-7細(xì)胞的影響39-49
• 4.1 引言39
• 4.2 實(shí)驗(yàn)材料與儀器39-40
• 4.2.1 細(xì)胞、材料及主要試劑39
• 4.2.2 主要實(shí)驗(yàn)儀器39-40
• 4.3 實(shí)驗(yàn)方法40
• 4.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)40
• 4.3.2 MTT檢測40
• 4.3.3 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡40
• 4.3.4 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞ROS水平40
• 4.3.5 Western印跡檢測相關(guān)蛋白的表達(dá)40
• 4.3.6 細(xì)胞總RNA提取及qRT-PCR40
• 4.4 結(jié)果與分析40-47
• 4.4.1 rBTI聯(lián)合紫杉醇對MCF-7細(xì)胞增殖的影響40-42
• 4.4.2 流式細(xì)胞檢測MCF-7細(xì)胞凋亡42-43
• 4.4.3 rBTI聯(lián)合紫杉醇對凋亡相關(guān)因子的影響43
• 4.4.4 流式細(xì)胞檢測細(xì)胞ROS水平43-45
• 4.4.5 rBTI聯(lián)合紫杉醇對NFκB/p65信號通路的影響45-47
• 4.5 小結(jié)47-49
• 總結(jié)與展望49-51
• 參考文獻(xiàn)51-56
• 攻讀學(xué)位期間取得的研究成果56-57
• 致謝57-58
• 個(gè)人簡介及聯(lián)系方式58-59
• 承諾書59-60

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號：1040963