本文關(guān)鍵詞：模擬微重力下的血清miRNAs研究

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【摘要】：長(zhǎng)期空間飛行過(guò)程中,由于重力的消失迫使機(jī)體的多種組織和器官去適應(yīng)新的微重力環(huán)境,從而產(chǎn)生一系列的適應(yīng)性變化,稱(chēng)之為“空間適應(yīng)綜合癥”。這些航天醫(yī)學(xué)問(wèn)題已成為人類(lèi)長(zhǎng)期太空探索的重要障礙之一,主要包括骨丟失、認(rèn)知功能損傷、肌肉萎縮、心血管功能紊亂等。航天微重力環(huán)境對(duì)航天員的生理健康和任務(wù)執(zhí)行造成了嚴(yán)重影響,如何對(duì)這些影響進(jìn)行監(jiān)測(cè)和防護(hù)并揭示其機(jī)制,是航天醫(yī)學(xué)研究的首要任務(wù)。開(kāi)發(fā)簡(jiǎn)單有效的檢測(cè)指標(biāo)對(duì)于航天員的生理健康監(jiān)測(cè)具有重要意義。同時(shí),以系統(tǒng)生物學(xué)的思維來(lái)探索微重力對(duì)機(jī)體動(dòng)態(tài)的、全身性的影響,將是航天醫(yī)學(xué)問(wèn)題研究的有效手段。本論文以尾吊大鼠作為主要的動(dòng)物模型,通過(guò)對(duì)血清miRNAs表達(dá)譜的研究來(lái)探索模擬微重力對(duì)機(jī)體的影響,獲得以下主要結(jié)果：首先對(duì)血清miRNAs的內(nèi)參基因進(jìn)行了篩選和驗(yàn)證。通過(guò)miRNAs芯片篩選,并結(jié)合多批次、大樣本的qPCR及2個(gè)專(zhuān)業(yè)內(nèi)參篩選軟件(geNorm和Normfinder)的運(yùn)算分析,確定了miR-25-3p是最穩(wěn)定的內(nèi)參基因。進(jìn)一步分析表明,miR-25-3p是一個(gè)在不同物種間高度保守的基因。它在大鼠尾吊、獼猴臥床等模擬微重力模型,以及大鼠OVX、絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松等模型中的表達(dá)均有很好的穩(wěn)定性,從而最終確定miR-25-3p可作為這些模型中穩(wěn)定的血清miRNAs內(nèi)參基因。這些結(jié)果為后續(xù)開(kāi)展的的血清miRNAs研究奠定了基礎(chǔ)。隨后我們對(duì)失重性骨丟失和絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松的血清miRNAs標(biāo)志物進(jìn)行了篩選。利用大鼠OVX血清miRNAs芯片技術(shù)高通量篩選差異表達(dá)的miRNAs,并經(jīng)qPCR驗(yàn)證得到15個(gè)下調(diào)的miRNA。進(jìn)一步結(jié)合臨床樣本檢測(cè)后發(fā)現(xiàn),其中miR-30b-5p在骨質(zhì)減少和骨質(zhì)疏松病人血清中都顯著下調(diào),miR-103-3p、 miR-142-3p和miR-328-3p在骨質(zhì)疏松病人血清中顯著下調(diào)。偏相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)它們與H-BMD之間均存在顯著的正相關(guān),而且miR-30b-5p和miR-142-3p還同時(shí)與]N-BMD顯著相關(guān)。這4個(gè)niRNAs可作為絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松的生物標(biāo)志物。利用獼猴臥床實(shí)驗(yàn)對(duì)模擬失重性骨丟失的標(biāo)志物進(jìn)行了鑒定,結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-30b-5p、miR-103-3p和miR-142-3p在臥床后獼猴血清中的表達(dá)顯著下降,ROC曲線(xiàn)分析表明它們有很好的診斷價(jià)值,但miR-328-3p未發(fā)生顯著變化。從而確定miR-30b-5p、miR-103-3p和miR-142-3p可作為模擬失重性骨丟失的標(biāo)志物。miRNA表達(dá)譜和代謝組學(xué)數(shù)據(jù)都包含了生理變化的重要信息,為了對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行深度挖掘,我們進(jìn)行了二者的聯(lián)合分析。血清miRNAs芯片和qPCR檢測(cè)確定了13個(gè)在尾吊4周和5周后大鼠血清中均上調(diào)的miRNAs,pather和DAVID軟件的分析表明它們與神經(jīng)系統(tǒng),尤其是海馬高度相關(guān)。連續(xù)尾吊5周后,血清代謝組發(fā)生顯著性變化,與變化miRNAs的預(yù)測(cè)靶基因進(jìn)行聯(lián)合分析發(fā)現(xiàn),模擬失重對(duì)機(jī)體的神經(jīng)系統(tǒng)尤其是海馬區(qū)有顯著影響。根據(jù)生物信息學(xué)分析結(jié)果,我們檢測(cè)了尾吊大鼠海馬組織miRNA、mRNA和蛋白的表達(dá),發(fā)現(xiàn)miR-383-5p的表達(dá)顯著上調(diào),同時(shí)其預(yù)測(cè)靶基因AQP4的mRNA和蛋白水平均顯著下調(diào),推測(cè)它可能直接受miR-383-5p的靶向調(diào)控。通過(guò)體外雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn),確認(rèn)了AQP4是miR-383-5p的靶基因。AQP4是調(diào)節(jié)腦組織水平衡的重要蛋白,也與海馬的學(xué)習(xí)記憶和認(rèn)知功能密切相關(guān)。因此,推測(cè)它的變化是微重力影響海馬功能的潛在機(jī)制之一,并可能與微重力下的血液頭向分布相關(guān)。綜上所述,我們通過(guò)對(duì)血清miRNAs的研究發(fā)現(xiàn)：miR-25-3p是模擬微重力模型和骨質(zhì)疏松模型穩(wěn)定的內(nèi)參基因；并篩選得到一組血清miRNAs可作為模擬失重性骨丟失和絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松的潛在標(biāo)志物；最后對(duì)模擬微重力導(dǎo)致的認(rèn)知功能損傷進(jìn)行了初步的機(jī)制探索。
【關(guān)鍵詞】：微重力 血清miRNAs 生物標(biāo)志物 骨質(zhì)疏松 代謝組學(xué) 海馬 認(rèn)知功能 AQP4
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類(lèi)號(hào)】：R85
【目錄】：

• 致謝6-7
• 摘要7-9
• Abstract9-12
• 縮略表12-20
• 第一章 緒論20-50
• 1.1 長(zhǎng)期空間飛行面臨的航天醫(yī)學(xué)問(wèn)題20-26
• 1.1.1 失重對(duì)骨的影響20-22
• 1.1.2 失重對(duì)認(rèn)知功能的影響22-24
• 1.1.3 失重對(duì)體液循環(huán)的影響24-25
• 1.1.4 失重對(duì)其他生理系統(tǒng)的影響25
• 1.1.5 組學(xué)在航天醫(yī)學(xué)研究中的應(yīng)用25-26
• 1.2 miRNAs概述26-29
• 1.2.1 miRNAs的發(fā)現(xiàn)26-27
• 1.2.2 miRNAs對(duì)骨的調(diào)控作用27-28
• 1.2.3 miRNA與海馬認(rèn)知功能28-29
• 1.3 循環(huán)miRNAs概述29-37
• 1.3.1 循環(huán)miRNAs的發(fā)現(xiàn)29-30
• 1.3.2 循環(huán)miRNAs的特點(diǎn)30
• 1.3.3 循環(huán)miRNAs的存在形式與分泌機(jī)制30-32
• 1.3.4 循環(huán)miRNAs的內(nèi)參研究32-33
• 1.3.5 循環(huán)miRNAs與疾病診斷33-35
• 1.3.5.1 循環(huán)miRNAs作為疾病的生物標(biāo)志物33-34
• 1.3.5.2 循環(huán)miRNAs作為骨質(zhì)疏松的生物標(biāo)志物34-35
• 1.3.6 循環(huán)miRNAs作為信號(hào)分子參與組織或細(xì)胞間相互調(diào)控35-37
• 1.3.7 循環(huán)miRNAs的組學(xué)研究37
• 1.4 總結(jié)37-38
• 參考文獻(xiàn)38-50
• 第二章 血清miRNAs內(nèi)參基因的篩選與鑒定50-79
• 2.1 引言50-51
• 2.2 實(shí)驗(yàn)材料51-54
• 2.2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與樣品51
• 2.2.2 實(shí)驗(yàn)儀器與耗材51-52
• 2.2.3 實(shí)驗(yàn)試劑52-53
• 2.2.4 溶液配制53-54
• 2.3 實(shí)驗(yàn)方法54-65
• 2.3.1 動(dòng)物模型的建立54-56
• 2.3.1.1 大鼠尾吊模型的建立54
• 2.3.1.2 大鼠卵巢摘除模型的建立54-55
• 2.3.1.3 獼猴頭低位臥床模型的建立55-56
• 2.3.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物取材56-57
• 2.3.2.1 血液采集和血清分離56
• 2.3.2.2 大鼠后肢骨分離56-57
• 2.3.3 原代顱骨成骨細(xì)胞分離培養(yǎng)與骨向誘導(dǎo)57
• 2.3.4 原代骨髓單核細(xì)胞破骨細(xì)胞向誘導(dǎo)分化57-58
• 2.3.5 μCT檢測(cè)分析58
• 2.3.6 miRNAs的提取58-62
• 2.3.6.1 血清miRNAs的提取58-59
• 2.3.6.2 細(xì)胞總RNAs的提取59-60
• 2.3.6.3 大鼠股骨總RNAs的提取60-61
• 2.3.6.4 總RNAs的質(zhì)量檢測(cè)61-62
• 2.3.7 尾吊大鼠血清miRNAs芯片檢測(cè)62-63
• 2.3.8 miRNA的表達(dá)檢測(cè)63-65
• 2.3.9 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析65
• 2.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果65-73
• 2.4.1 大鼠尾吊模型的建立65-66
• 2.4.2 血清miRNAs候選內(nèi)參基因的選擇66-67
• 2.4.3 血清miRNAs內(nèi)參基因的選擇與驗(yàn)證67-70
• 2.4.4 miR-25-3p是模擬微重力模型穩(wěn)定的血清miRNAs內(nèi)參基因70-71
• 2.4.5 miR-25-3p作為內(nèi)參基因在骨質(zhì)疏松模型中的穩(wěn)定性71-73
• 2.5 討論73-75
• 2.6 本章小結(jié)75
• 參考文獻(xiàn)75-79
• 第三章 骨質(zhì)疏松血清miRNAs標(biāo)志物的篩選79-95
• 3.1 引言79-80
• 3.2 實(shí)驗(yàn)材料80-81
• 3.2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與樣品80
• 3.2.2 實(shí)驗(yàn)儀器與耗材80
• 3.2.3 實(shí)驗(yàn)試劑80-81
• 3.3 實(shí)驗(yàn)方法81-83
• 3.3.1 血清樣品的獲取81
• 3.3.2 OVX大鼠血清miRNAs芯片檢測(cè)81
• 3.3.3 血清miRNA的提取與檢測(cè)81-82
• 3.3.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析82-83
• 3.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果83-89
• 3.4.1 大鼠OVX模型中差異表達(dá)的血清miRNAs83-84
• 3.4.2 血清miRNAs作為絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松的潛在標(biāo)志物84-87
• 3.4.3 血清miRNAs作為模擬失重性骨丟失的潛在標(biāo)志物87-89
• 3.5 討論89-91
• 3.6 本章小結(jié)91
• 參考文獻(xiàn)91-95
• 第四章 血清miRNAs表達(dá)譜與代謝組學(xué)的聯(lián)合分析95-106
• 4.1 引言95
• 4.2 實(shí)驗(yàn)材料95-96
• 4.2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與樣品95
• 4.2.2 實(shí)驗(yàn)儀器與耗材95-96
• 4.2.3 實(shí)驗(yàn)試劑96
• 4.3 實(shí)驗(yàn)方法96-98
• 4.3.1 血清樣品的獲取與檢測(cè)96
• 4.3.2 血清代謝組學(xué)檢測(cè)96-98
• 4.3.2.1 血清樣本預(yù)處理96-97
• 4.3.2.2 血清樣本LC-MS分析97
• 4.3.2.3 血清樣本數(shù)據(jù)預(yù)處理97
• 4.3.2.4 數(shù)據(jù)多變量分析和代謝標(biāo)志物鑒定97-98
• 4.3.3 生物信息學(xué)分析98
• 4.3.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析98
• 4.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果98-104
• 4.4.1 大鼠尾吊模型中差異表達(dá)的血清miRNAs98-102
• 4.4.2 尾吊大鼠血清代謝組的檢測(cè)與分析102-103
• 4.4.3 尾吊大鼠血清miRNAs芯片和代謝組的聯(lián)合分析103-104
• 4.5 討論104
• 4.6 本章小結(jié)104-105
• 參考文獻(xiàn)105-106
• 第五章 大鼠尾吊模擬微重力對(duì)海馬的影響106-126
• 5.1 引言106
• 5.2 實(shí)驗(yàn)材料106-109
• 5.2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與細(xì)胞106-107
• 5.2.2 實(shí)驗(yàn)儀器與耗材107
• 5.2.3 實(shí)驗(yàn)試劑107-109
• 5.2.4 溶液配制109
• 5.3 實(shí)驗(yàn)方法109-116
• 5.3.1 mRNAs的表達(dá)檢測(cè)109-111
• 5.3.2 組織/細(xì)胞蛋白提取111-112
• 5.3.2.1 海馬組織蛋白提取111-112
• 5.3.2.2 細(xì)胞蛋白提取112
• 5.3.2.3 蛋白濃度測(cè)定112
• 5.3.3 AQP4基因3'-UTR熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒構(gòu)建112-115
• 5.3.3.1 AQP4的3'-UTR擴(kuò)增112-113
• 5.3.3.2 熒光素酶報(bào)告基因載體準(zhǔn)備113-114
• 5.3.3.3 重組質(zhì)粒構(gòu)建114-115
• 5.3.4 Western blot檢測(cè)蛋白表達(dá)115
• 5.3.5 細(xì)胞轉(zhuǎn)染115-116
• 5.3.6 雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)116
• 5.3.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析116
• 5.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果116-121
• 5.4.1 尾吊模擬微重力對(duì)大鼠海馬組織miRNAs/mRNAs表達(dá)的影響116-119
• 5.4.2 尾吊模擬微重力對(duì)大鼠海馬組織蛋白表達(dá)的影響119-120
• 5.4.3 AQP4是miR-383-5p的靶基因120-121
• 5.5 討論121-123
• 5.6 本章小結(jié)123
• 參考文獻(xiàn)123-126
• 第六章 結(jié)論與展望126-128
• 附錄Ⅰ128-129
• 附錄Ⅱ129

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6 任波;馬迪;李毅;;地高辛標(biāo)記探針結(jié)合化學(xué)發(fā)光技術(shù)快速靈敏檢測(cè)植物總RNA中的miRNAs方法[A];中國(guó)植物病理學(xué)會(huì)2005年學(xué)術(shù)年會(huì)暨植物病理學(xué)報(bào)創(chuàng)刊50周年紀(jì)念會(huì)論文集[C];2005年

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6 江冬瑞;人乳腺癌MCF-7細(xì)胞在不同HER-2水平下外泌型miRNAs表達(dá)譜檢測(cè)[D];安徽醫(yī)科大學(xué);2016年

7 杜新;肉牛H-FABP基因分子特征及肌內(nèi)脂肪沉積相關(guān)miRNAs鑒定[D];沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué);2016年

8 馬蘇日古嘎;UC-MSCs條件培養(yǎng)基對(duì)HepG2影響的miRNAs差異表達(dá)譜分析及miR-3065-5p功能的初步探討[D];內(nèi)蒙古大學(xué);2016年

9 孟麗雅;惡性轉(zhuǎn)化BEAS-2B細(xì)胞lncRNAs與miRNAs的差異表達(dá)[D];鄭州大學(xué);2016年

10 趙海軍;應(yīng)用微陣列芯片技術(shù)分析先天性巨結(jié)腸miRNAs表達(dá)譜差異[D];南方醫(yī)科大學(xué);2016年

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本文編號(hào)：1057640