本文關(guān)鍵詞：以IspD為靶點(diǎn)的新型抗結(jié)核藥物篩選研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis, MTB)的耐藥問題日趨嚴(yán)重,針對(duì)新靶標(biāo)開發(fā)全新機(jī)制的抗結(jié)核藥物是抗擊耐藥結(jié)核分枝桿菌的有效途徑。MTB細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)獨(dú)特,對(duì)于MTB的生長(zhǎng)繁殖以及致病性至關(guān)重要。因此,MTB的細(xì)胞壁生物合成途徑蘊(yùn)含著大量潛在的抗結(jié)核新靶標(biāo)。異戊烯焦磷酸(isopentenyl diphosphate, IPP)及其同分異構(gòu)體二甲烯丙基焦磷酸(dimethylallyl diphosphate, DMAPP)是MTB細(xì)胞壁中肽聚糖層和阿拉伯半乳糖層的必須前體,2-C-甲基-D-赤蘚糖醇磷酸(2-C-methyl-D-erythritol-4-phosphate, MEP)途徑是MTB生物合成IPP和DMAPP的唯一途徑。該途徑共有8個(gè)蛋白參與催化反應(yīng),2-C-甲基-D-赤蘚糖醇-4-磷酸-胞嘧啶轉(zhuǎn)移酶(2-C-methyl-D-erythritol-4-phosphate cytidylyltransferase, IspD)是該途徑的關(guān)鍵限速酶。本研究旨在獲得靶向IspD的新型抗結(jié)核藥物,并以此為探針驗(yàn)證IspD作為抗結(jié)核新靶標(biāo)的可行性。本論文共完成了三個(gè)主要的研究?jī)?nèi)容：第一是采用MTBH37Rv的全細(xì)胞篩選模型對(duì)化合物庫4萬個(gè)樣品進(jìn)行初篩和復(fù)篩,得到159個(gè)在質(zhì)量濃度為20μg/ml時(shí)能抑制MTB生長(zhǎng)的陽性化合物,陽性率為0.4%；第二是以MTB H37Rv基因組為模板,通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction, PCR)擴(kuò)增ispD基因,連接進(jìn)入表達(dá)載體pET28a(+),轉(zhuǎn)化E. coli BL21(DE3)pLysS,構(gòu)建結(jié)核分枝桿菌2-C-甲基-D-赤蘚糖醇-4-磷酸-胞嘧啶轉(zhuǎn)移酶(Mycobacterium tuberculosis 2-C-methyl-D-erythritol-4-phosphate cytidylyltransferase, MtlspD)重組表達(dá)菌株,誘導(dǎo)表達(dá)和分離純化MtIspD,建立和優(yōu)化MtIspD酶活測(cè)定方法,構(gòu)建MtIspD酶抑制劑篩選模型,應(yīng)用該模型從具有抗結(jié)核活性的化合物中篩選得到5個(gè)MtIspD的抑制劑,其中的陽性化合物IMB-4901對(duì)MtIspD及MTB均有較強(qiáng)的抑制活性,對(duì)MtIspD的IC50為19.3 μg/ml,對(duì)MTBH37Rv的MIC為1.6μg/ml;酶動(dòng)力學(xué)研究表明,化合物IMB-4901是底物MEP和CTP競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑,Ki分別為24.9μg/ml和15.1 μg/ml；抗菌譜測(cè)定結(jié)果表明,IMB-4901選擇性的作用于革蘭氏陽性菌,特別是對(duì)MTB有很強(qiáng)的選擇性抑制作用；IMB-4901對(duì)非洲綠猴腎細(xì)胞(Vero)和人肝癌細(xì)胞(HepG2)有一定的毒性,其TC50分別為1.8μg/ml和1.9μg/ml；第三是以pET28a(+)::ispD為模板,克隆ispD基因的前320 bp,構(gòu)建可在MTB中可控表達(dá)MtIspD的質(zhì)粒,為最終獲得可控表達(dá)MtlspD的MTB突變菌株,確認(rèn)IMB-4901的作用靶標(biāo)奠定基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：結(jié)核分枝桿菌 MtIspD 抑制劑 篩選模型 藥物靶標(biāo)
【學(xué)位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R978.3
【目錄】：

• 縮略語表7-9
• 中文摘要9-10
• 英文摘要10-12
• 前言12-16
• 實(shí)驗(yàn)材料與儀器16-22
• 1 菌株及細(xì)胞16
• 2 基因組和質(zhì)粒16
• 3 培養(yǎng)基16-18
• 3.1 E.coli培養(yǎng)基16-17
• 3.2 分桿桿菌培養(yǎng)基17
• 3.3 其他菌株藥敏實(shí)驗(yàn)所用培養(yǎng)基17-18
• 3.4 Vero和HepG2培養(yǎng)基18
• 4 主要試劑18
• 5 溶液18-20
• 5.1 抗生素溶液18-19
• 5.2 蛋白相關(guān)溶液19-20
• 6 試劑盒20-21
• 7 工具酶21
• 8 主要儀器21-22
• 實(shí)驗(yàn)方法22-43
• 1 基于MTB的表型篩選22
• 1.1 化合庫中樣品的初篩22
• 1.2 化合物樣品的拆分及復(fù)篩22
• 2 MtIspD酶抑制劑的篩選22-35
• 2.1 ispD基因的擴(kuò)增22-24
• 2.2 表達(dá)載體的構(gòu)建24-27
• 2.3 表達(dá)菌株的構(gòu)建27-28
• 2.4 MtIspD蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)28
• 2.5 MtIspD蛋白純化及蛋白質(zhì)含量測(cè)定28-30
• 2.6 MtIspD蛋白的定量30
• 2.7 MtIspD蛋白的SDS-PAGE電泳檢測(cè)30-32
• 2.8 MtIspD活性測(cè)定原理及方法32
• 2.9 MtIspD酶活性測(cè)定體系優(yōu)化32-33
• 2.10 MtIspD抑制劑篩選模型的確立33-35
• 3 抑制劑半數(shù)抑制濃度(IC_(50))測(cè)定35
• 4 抑制劑的體外抗結(jié)核活性測(cè)定35-36
• 5 抑制劑抗菌譜活性測(cè)定36
• 6 化合物IMB-4901對(duì)MtIspD的動(dòng)力學(xué)研究36
• 7 化合物IMB-4901的細(xì)胞毒性研究36-37
• 8 MtIspD可控表達(dá)菌株的構(gòu)建37-43
• 8.1 構(gòu)建MtIspD可控表達(dá)菌株的目的及意義37-38
• 8.2 MtIspD可控表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建流程38
• 8.3 ispD基因前320bp的獲得38-39
• 8.4 PCR產(chǎn)物的純化39-40
• 8.5 純化的PCR產(chǎn)物雙酶切處理及回收40
• 8.6 pAZI 9479的雙酶切處理及片段回收40-41
• 8.7 酶切后ispD前320bp與pAZI9479連接41
• 8.8 連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞41
• 8.9 陽性克隆鑒定41
• 8.10 陽性克隆質(zhì)粒的提取41-42
• 8.11 重組質(zhì)粒測(cè)序42
• 8.12 重組質(zhì)粒pAZI 9479：：ispDqian320bp電轉(zhuǎn)入H37Rv42-43
• 實(shí)驗(yàn)結(jié)果43-58
• 1 基于MTB(H37Rv)表型篩選抗結(jié)核活性化合物43
• 2 MtIspD酶抑制劑的篩選43-51
• 2.1 表達(dá)質(zhì)粒pET28a(+)：：ispD的構(gòu)建與驗(yàn)證43-45
• 2.2 MtIspD蛋白的制備45-47
• 2.3 酶活力測(cè)定47-48
• 2.4 酶活測(cè)定體系的優(yōu)化48-50
• 2.5 MtIspD抑制劑篩選模型50
• 2.6 MtIspD抑制劑的篩選50-51
• 3 MtIspD抑制劑對(duì)H37Rv的最低抑菌濃度(MIC)51-52
• 4 MtIspD抑制劑的抗菌譜52-53
• 5 化合物IMB-4901對(duì)MtIspD的抑制動(dòng)力學(xué)研究53-54
• 6 化合物IMB-4901對(duì)肝腎細(xì)胞毒性研究54-55
• 7 MtIspD可控表達(dá)菌株的構(gòu)建55-58
• 7.1 ispD基因前320bp片段的獲得55
• 7.2 純化的PCR產(chǎn)物雙酶切55
• 7.3 pAZI 9479的雙酶切55-56
• 7.4 陽性克隆菌落PCR鑒定56
• 7.5 重組質(zhì)粒pAZI 9479：：ispDqian320bp測(cè)序56
• 7.6 重組質(zhì)粒pAZI 9479：：ispDqian320bp電轉(zhuǎn)入H37Rv56-58
• 討論58-60
• 結(jié)論60-61
• 致謝61-62
• 參考文獻(xiàn)62-63
• 文獻(xiàn)綜述63-76
• 參考文獻(xiàn)70-76
• 附錄76-78

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 李薇;薛欣;楚雍烈;邱奕;宋娟;鄭建武;;結(jié)核分枝桿菌乙胺丁醇耐藥與embB基因突變的相關(guān)性研究[J];衛(wèi)生研究;2010年04期

  本文關(guān)鍵詞：以IspD為靶點(diǎn)的新型抗結(jié)核藥物篩選研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

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本文編號(hào)：411870