本文關(guān)鍵詞：環(huán)磷酸腺苷在大鼠胰島素分泌中的作用及其機制，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的:探討腺苷酸環(huán)化酶(AC)/環(huán)磷酸腺苷(c AMP)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在大鼠胰島素分泌中的作用,通過使用AC激動劑Forskolin和抑制劑SQ22536研究c AMP影響胰島素分泌的機制。方法:(1)處死大鼠,打開大鼠腹腔,將膠原酶P(Collagenase P)液從胰總管打入胰腺,可看到附著在胃和小腸的胰腺,迅速剪下胰腺,將其放到38℃水浴震蕩消化11 min,采用Histopaque-1077,離心分離出大鼠胰島。用DispaseⅡ消化胰島,可得到大鼠原代胰島β細胞,為了使研究結(jié)果最為接近大鼠生理狀態(tài),以上方法分得的胰島和細胞最多使用7天。(2)DTZ染液可將胰島染成猩紅色,對其進行染色鑒定,室溫下染色胰島10分鐘,在光學顯微鏡下觀察胰島形態(tài)。對胰島進行活性檢測可用AO/PI染液孵育胰島,用490 nm激發(fā)光,510 nm發(fā)射光觀察。(3)得到的胰島在37℃細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng),用放射性免疫分析法檢測AC激動劑Forskolin和抑制劑SQ22536對大鼠胰島素分泌及環(huán)磷酸腺苷(c AMP)含量的影響。(4)采用膜片鉗技術(shù)檢測藥物對胰島β細胞電壓依賴性鉀通道(KV)、動作電位(AP)的影響。(5)采用離子成像技術(shù)檢測Forskolin和SQ22536對胰島β細胞內(nèi)鈣離子濃度的影響。結(jié)果:(1)用膠原酶P,Histopaque-1077梯度離心法分得的胰島,大小不一,折光性好,直徑在100-300μm。胰島β細胞細胞呈球形,質(zhì)地光滑,表面圓潤。(2)胰島經(jīng)DTZ染色成猩紅色,顯示在以上實驗中分離為胰島,且純度較高。95%以上的胰島經(jīng)AO/PI染色后發(fā)綠色熒光,胰島活性好。(3)在胰島素分泌實驗中,胰島有明顯的葡萄糖依賴性的促胰島素分泌作用;在不同葡萄糖濃度下胰島素分泌的標化值分別是:(1.00±0.38)用特異的AC激動劑Forskolin和廣泛應(yīng)用的AC抑制劑SQ22536,在8.3m M葡萄糖的基礎(chǔ)上,Forskolin增加了胰島素分泌(8.3 G,n=6vs8.3G+Forskolin,10μM,n=6,P0.05);(4)在有SQ2253610μ的作用下,可以阻斷Forskolin增加胰島素分泌的作用(8.3G+Forskolinvs8.3G+SQ22536+Forskolin,10μM,n=6,P0.05)。(5)在c AMP量檢測試驗中,所測c AMP值分別為2.8G組999.68±95.82fmol/10islets/hr,8.3G組1021.77±73.73fmol/10islets/hr,8.3G+SQ22536組1187.23±133.13fmol 10islets/hr,8.3G+Forskolin組3682.14±395.38fmol/10islets/hr,8.3G+SQ22536+Forskolin組2947.21±157.63 fmol/10islets/hr。Forskolin增加了胰島β細胞內(nèi)生物合成的c AMP(8.3G n=6 vs 8.3G+Forskolin,10μM,n=6,P0.01);同時c AMP的量沒有影響(8.3Gvs8.3G+SQ22536,10μM,n=6,P0.05);但是SQ22536可以部分阻斷Forskolin增加了胰島β細胞內(nèi)生物合成的c AMP的量(8.3G+Forskolin,10μM,n=6vs8.3G+SQ22536+Forskolin,10μM,n=6,P0.05)。(6)通過膜片鉗實驗看出,KV通道的開放可被Forskolin極大地抑制,減小KV電流,同樣的情況下SQ22536對KV電流沒有影響,而給予Forskolin+SQ22536加藥刺激,則可以發(fā)現(xiàn)SQ22536部分阻斷Forskolin抑制KV通道開放的作用。在80m V的刺激時,記錄電流密度為Forskolin(n=6,76.67±2.78p A/p F),SQ22536+Forskolin(n=6,109.89±4.58p A/p F)與對照組(n=6,139.62±4.54p A/p F)相比明顯地抑制KV電流;Forskolin(n=6,76.67±2.78p A/p)與SQ2253+Forskolin(n=6,109.89±4.58p A/p F)相比有統(tǒng)計學差異;而SQ22536(n=6,132.43±2.78p A/p F)對KV的影響無統(tǒng)計學差異。在二甲基亞砜DMSO加藥組與對照組的比較中,尚未發(fā)現(xiàn)DMSO對KV通道有影響。(7)使用膜片鉗檢測動作電位時程(APD),Forskolin加藥組(70.28±5.18ms,10μM,n=8)相比較對照組(40.61±3.77ms,n=8),p0.01;Forskolin+SQ22536加藥組(52.73±2.19,10μM,n=8)與Forskolin加藥組比較,可以減少Forskolin對動作電位的延長,p0.05。(8)在離子成像試驗中得到,在低葡萄糖濃度,尚未發(fā)現(xiàn)Forskolin(10μM,n=8)可以使細胞內(nèi)的鈣離子濃度有變化。在高糖的基礎(chǔ)上,給予Forskolin(10μM,n=8)的刺激,發(fā)現(xiàn)對細胞內(nèi)的鈣離子濃度的變化有顯著影響;同樣條件,先給予SQ22536(SQ,10μM,n=8)的加藥刺激,未見明顯變化,持續(xù)一段時間以后,接著給細胞Forskolin(FSK,10μM,n=8)的刺激。結(jié)論:(1)梯度分離法分離純化胰島,消化得到的胰島β細胞狀態(tài)良好。(2)實驗中分得的胰島DTZ染色顯示純度高,AO/PI染色說明活性良好。(3)在正常生理狀態(tài)下,胰島功能好。Forskolin有促胰島素分泌作用,可被SQ22536所減弱,而SQ22536對胰島素分泌沒有影響,說明胰島素分泌量被c AMP所增加。(4)加入藥物Forskolin能使細胞內(nèi)的c AMP含量明顯升高,且Forskolin升高c AMP的作用可以被SQ22536削減。(5)Forskolin明顯抑制KV通道,而這種作用可被SQ22536所消除,說明c AMP會影響KV通道的開放和閉合。(6)Forskolin顯著延長ADP,SQ22536可以縮短Forskolin對AP時程的延長,說明增加細胞內(nèi)c AMP的量可以延長APD。(7)胰島細胞內(nèi)的鈣離子濃度在加入Forskolin后明顯增加了,SQ22536能夠消弱Forskolin升高鈣離子濃度的作用。綜上所述,在胰島β細胞上通過使用AC激動劑Forskolin增加細胞內(nèi)在c AMP的生物合成,c AMP可以抑制KV通道的開放,使APD作用延長,使鈣離子進入到細胞內(nèi)的時間延長,使細胞內(nèi)的鈣離子濃度顯著增多,最終使胰島素的分泌的量增加;在加入藥物SQ22536,尚未發(fā)現(xiàn)該藥其本身對胰島素分泌及KV電流有影響,但該藥可以阻斷Forskolin對胰島素分泌、c AMP的生物合成量及KV電流、ADP、細胞內(nèi)鈣離子濃度的作用,提示細胞內(nèi)的c AMP含量的變化可以影響Kv通道、ADP、細胞內(nèi)鈣離子濃度,進而對胰島素的分泌量產(chǎn)生影響。
【關(guān)鍵詞】：胰島β細胞 環(huán)磷酸腺苷 胰島素分泌 電壓依賴性鉀通道 動作電位時程
【學位授予單位】：山西醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R965
【目錄】：

• 中文摘要6-9
• 英文摘要9-12
• 常用縮寫詞中英文對照表12-13
• 前言13-15
• 1 材料與方法15-23
• 1.1 藥品與試劑15
• 1.2 實驗所需溶液的配置15-16
• 1.3 主要實驗儀器16
• 1.4 動物16
• 1.5 分離純化大鼠胰島及細胞的分離與培養(yǎng)16-18
• 1.6 胰島活性測定18-19
• 1.7 胰島素分泌實驗19-20
• 1.8 c AMP含量檢測20
• 1.9 電生理實驗---膜片鉗實驗20-21
• 1.10離子成像實驗測定胰島β細胞內(nèi)部鈣離子濃度的變化21-22
• 1.11統(tǒng)計處理22-23
• 2 結(jié)果23-37
• 2.1 SD大鼠胰島的功能檢測23-26
• 2.2 胰島β細胞的分離培養(yǎng)26-27
• 2.3 c AMP對胰島素分泌的影響27-29
• 2.4 c AMP影響胰島素分泌機制的研究29-35
• 2.5 檢測溶劑DMSO對胰島β細胞上KV通道電流的影響35-37
• 3 討論37-39
• 4 結(jié)論39-40
• 參考文獻40-43
• 綜述43-54
• 參考文獻49-54
• 致謝54-55
• 在學期間承擔/參與的科研課題與研究成果55-56
• 個人簡歷56

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前2條

1 宮璀璀;鄭乃剛;王廣蘭;吳景蘭;李璇;;8-Br-cAMP和槲皮素聯(lián)合應(yīng)用對Eca-109細胞增變基因表型的影響[J];河南醫(yī)學研究;2010年03期

2 趙家偉,馬鳳海,羅梅,李軍,鄒云紅,王煜,李秀鈞;胰島β細胞胰島素抵抗的證據(jù)[J];中華內(nèi)分泌代謝雜志;2005年04期

  本文關(guān)鍵詞：環(huán)磷酸腺苷在大鼠胰島素分泌中的作用及其機制，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：411074