本文關(guān)鍵詞：免疫促凋亡分子e23sFv-TD-tBid在乳腺癌轉(zhuǎn)移模型中的活性評價，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的:乳腺癌是全世界女性中發(fā)病率最高的惡性腫瘤,是癌癥死亡的第二大原因[1]。約16%到20%的病患是深度或轉(zhuǎn)移型,50%的早期患者最終也會發(fā)展為轉(zhuǎn)移[2]。手術(shù)治療后復(fù)發(fā)率較高,放化療由于缺乏特異性對正常組織的毒害大。故本課題研究新一代靶向療法—免疫促凋亡分子e23sFv-TD-tBid在乳腺癌轉(zhuǎn)移模型中的應(yīng)用,為其成為臨床治療的候選分子提供依據(jù)。方法:由第四軍醫(yī)大學(xué)生化與分子生物學(xué)科室研發(fā)的免疫促凋亡分子e23sFv-TD-tBid由靶向HER2的抗體e23sFv,轉(zhuǎn)位域TD及人體促凋亡分子t Bid構(gòu)成。小鼠乳腺癌轉(zhuǎn)移模型在很重要的層面上可以模擬人體乳腺癌的生物學(xué)特征,但在建模過程當(dāng)中具備高浸潤性的BALB/c乳腺癌上皮細(xì)胞4T1 HER2表達(dá)量較低,而且與人腫瘤細(xì)胞表面HER2分子存在序列層面的差別,故在評價人源性的目標(biāo)分子的療效時需對其進(jìn)行HER2的人源化改造[4]。近年來,新型活體成像技術(shù)在轉(zhuǎn)移灶的檢測和腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移的監(jiān)測方面發(fā)揮著重要作用,其發(fā)光原理是熒光素底物與熒光酶結(jié)合產(chǎn)生光學(xué)信號,故需對4T1進(jìn)行報告基因Fluc的修飾,使其表達(dá)熒光酶[5]。實驗通過慢病毒體系對4T1進(jìn)行修飾得到穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株Fluc-4T1/HER2,通過熒光酶活性檢測實驗及體外發(fā)光實驗確定作為報告基因的熒光素酶的成功表達(dá),經(jīng)流式細(xì)胞檢測技術(shù)確定表面HER2蛋白的過表達(dá)。通過尾靜脈、左心室、原位接種方式建立乳腺癌轉(zhuǎn)移模型,對比得出條件穩(wěn)定、方便可行、適于評價的途徑,用于e23sFv-TD-tBid生物活性的評價。功能學(xué)實驗,體外通過MTT檢測e23sFv-TD-tBid對Fluc-4T1/HER2殺傷作用,體內(nèi)正式構(gòu)建轉(zhuǎn)移模型,分高中低劑量注入e23sFv-TD-tBid蛋白,分別從轉(zhuǎn)移信號、成瘤結(jié)節(jié)統(tǒng)計、Tunnel凋亡結(jié)果這3個指標(biāo)得出目標(biāo)殺傷分子對腫瘤細(xì)胞的作用,進(jìn)而評價其在轉(zhuǎn)移模型中的生物活性。結(jié)果:熒光酶活性檢測實驗,4T1和4T1-FLuc的光學(xué)信號有顯著性差異;體外發(fā)光實驗4T1-FLuc的光學(xué)信號隨細(xì)胞濃度呈梯度變化;流式細(xì)胞檢測技術(shù)通過對比感染前后HER2的表達(dá)分?jǐn)?shù)說明HER2的陽性表達(dá);三種方法均成功的構(gòu)建乳腺癌轉(zhuǎn)移模型,區(qū)別在于轉(zhuǎn)移時間與轉(zhuǎn)移部位;MTT結(jié)果呈現(xiàn)Fluc-4T1/HER2細(xì)胞的生存率與給藥濃度的負(fù)向相關(guān)關(guān)系;體內(nèi)實驗,轉(zhuǎn)移信號圖說明給藥組與對照組轉(zhuǎn)移程度有顯著性差異,給藥濃度越大,轉(zhuǎn)移程度越小;肺結(jié)節(jié)統(tǒng)計圖說明給藥組與對照組肺結(jié)節(jié)數(shù)目有統(tǒng)計學(xué)差異,給藥濃度越大,肺轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)越少;Tunnel染色結(jié)果說明藥物濃度愈大,細(xì)胞殺傷效應(yīng)愈強(qiáng)。結(jié)論:熒光酶活性檢測實驗、體外發(fā)光實驗及流式細(xì)胞檢測技術(shù)說明穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系Fluc-4T1/HER2的成功建立;對比三種方法,尾靜脈注射方式轉(zhuǎn)移部位穩(wěn)定、發(fā)生率高、周期短、易于控制細(xì)胞數(shù)量,適合研究轉(zhuǎn)移后期的治療;體內(nèi)體外實驗均證實e23sFv-TD-tBid對Fluc-4T1/HER2具有殺傷作用;可以減小轉(zhuǎn)移程度、延長轉(zhuǎn)移時間、增進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡。
【關(guān)鍵詞】：表皮生長因子受體 免疫促凋亡分子 基因修飾 轉(zhuǎn)移瘤模型 活體成像
【學(xué)位授予單位】：山西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R96
【目錄】：

• 中文摘要6-8
• 英文摘要8-11
• 常用縮寫詞中英文對照表11-12
• 前言12-14
• 第一部分 BALB/c乳腺癌上皮細(xì)胞 4T1的基因修飾14-27
• 1 材料與方法14-21
• 1.1 實驗材料14-15
• 1.2 4T1細(xì)胞的培養(yǎng)及藥殺實驗15-17
• 1.3 慢病毒包裝17-18
• 1.4 Fluc-4T1/HER2的穩(wěn)定建系18-21
• 2 結(jié)果21-23
• 2.1 4T1細(xì)胞藥物殺傷預(yù)實驗結(jié)果21
• 2.2 報告基因Fluc的檢測結(jié)果21-22
• 2.3 HER2基因的檢測結(jié)果22-23
• 3 討論23-26
• 3.1 細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)應(yīng)注意的問題23
• 3.2 HER2/4T1-Luc穩(wěn)定建系的意義23-24
• 3.3 細(xì)胞藥殺預(yù)實驗的意義24
• 3.4 載體的耐藥性24
• 3.5 包裝慢病毒應(yīng)注意的問題24-26
• 4 結(jié)論26-27
• 第二部分 乳腺癌轉(zhuǎn)移模型的建立27-38
• 1 材料與方法27-31
• 1.1 實驗材料27-28
• 1.2 三種建模途徑的對比28-31
• 2 結(jié)果31-35
• 2.1 活體成像結(jié)果31-33
• 2.2 HE染色結(jié)果33-34
• 2.3 轉(zhuǎn)移情況對比結(jié)果34-35
• 3 討論35-37
• 3.1 建模細(xì)胞的狀態(tài)35
• 3.2 乳房墊原位注射建模時應(yīng)注意的問題35
• 3.3 尾靜脈注射建模時應(yīng)注意的問題35
• 3.4 左心室注射建模時應(yīng)注意的問題35-37
• 4 結(jié)論37-38
• 第三部分 e23sFv-TD-t Bid的功能學(xué)實驗38-49
• 1 材料與方法38-42
• 1.1 實驗材料38-39
• 1.2 目標(biāo)促凋亡分子e23sFv-TD-tBid對Fluc-4T1/HER2細(xì)胞的生長抑制實驗39-40
• 1.3 目標(biāo)促凋亡分子e23sFv-TD-tBid的體內(nèi)抗乳腺癌轉(zhuǎn)移活性40-42
• 2 結(jié)果42-47
• 2.1 e23sFv-TD-tBid對Fluc-4T1/HER2細(xì)胞的生長抑制實驗結(jié)果42-44
• 2.2 免疫促凋亡分子e23sFv-TD-tBid的體內(nèi)抗乳腺癌轉(zhuǎn)移結(jié)果44-47
• 3 討論47-48
• 3.1 體內(nèi)體外實驗結(jié)合的意義47
• 3.2 給藥劑量的設(shè)定47
• 3.3 藥物分子競爭結(jié)合的飽和性47-48
• 4 結(jié)論48-49
• 參考文獻(xiàn)49-51
• 綜述51-64
• 參考文獻(xiàn)60-64
• 致謝64-65
• 在學(xué)期間承擔(dān)/參與的科研課題與研究成果65-66
• 個人簡歷66

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本文編號：391802