本文關(guān)鍵詞：以hT ERT為靶點(diǎn)設(shè)計(jì)合成的新型二氫吡唑類化合物抑制人肝癌細(xì)胞株SMMC-7721增殖的作用機(jī)制研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：人端粒酶是由人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶催化亞單位(hTERT)、人端粒酶RNA(hTR)以及人端粒酶相關(guān)蛋白(hTP1)等部分組成。端粒酶自1994年被發(fā)現(xiàn)以來,由于其在負(fù)責(zé)維持染色體完整性、細(xì)胞永生化以及腫瘤發(fā)生發(fā)展方面的關(guān)鍵作用而被廣泛研究。因此,以端粒酶作為抗腫瘤藥物篩選的新靶點(diǎn)成為了當(dāng)下研究的熱點(diǎn),人們雖已發(fā)現(xiàn)或者設(shè)計(jì)合成了具備一定作用的抑制劑,但由于直到2008年端粒酶的晶體結(jié)構(gòu)才被確認(rèn),以hTERT為作用靶點(diǎn)的高選擇性和高效的先導(dǎo)結(jié)構(gòu)及其藥理學(xué)作用機(jī)制研究至今仍然很少有報(bào)道。因此,本課題組基于端粒酶hTERT蛋白的晶體結(jié)構(gòu)和潛在活性中心,初步建立了分子對接模型,虛擬篩選出了一些高活性的骨架結(jié)構(gòu),并以此為骨架基礎(chǔ)設(shè)計(jì)合成了一系列小分子化合物。同時(shí)對這一系列合成的小分子化合物進(jìn)行抗癌活性篩選和藥理學(xué)機(jī)制研究。本課題的主要研究內(nèi)容如下:1.目標(biāo)化合物設(shè)計(jì)與合成基于端粒酶hTERT蛋白的晶體結(jié)構(gòu)和潛在活性中心,初步建立了該抑制劑的分子對接模型,虛擬篩選出了一些高活性的骨架結(jié)構(gòu)的化合物,并通過藥物化學(xué)的方法合成出這一系列化合物。2.檢測小分子化合物對腫瘤細(xì)胞株增殖的影響對設(shè)計(jì)合成的小分子化合物進(jìn)行抗癌活性篩選:在人肝癌細(xì)胞株smmc-7721、人肝癌細(xì)胞株hepg2、人胃癌細(xì)胞株mgc-803以及人乳腺癌細(xì)胞株mcf-7上進(jìn)行mtt實(shí)驗(yàn),結(jié)果發(fā)現(xiàn)這一系列化合物中化合物4a對smmc-7721腫瘤細(xì)胞的增殖作用抑制效果最明顯。同時(shí),通過流式細(xì)胞術(shù)觀察化合物4a對smmc-7721腫瘤細(xì)胞周期的影響,實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)smmc-7721細(xì)胞經(jīng)化合物4a處理48h后s期細(xì)胞數(shù)顯著增多,而在g0/g1期細(xì)胞顯著減少,這提示化合物4a是通過阻滯細(xì)胞于s期實(shí)現(xiàn)抑制細(xì)胞增殖作用的。3.檢測化合物4a對端粒酶活性以及htert的作用通過改良的trap實(shí)驗(yàn)法檢測腫瘤細(xì)胞中端粒酶活性:實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,化合物4a對端粒酶活性亦表現(xiàn)出較強(qiáng)的抑制作用,ic50值為7.81±1.32μm。同時(shí)通過westernblot實(shí)驗(yàn)檢測htert蛋白表達(dá)變化,結(jié)果顯示用化合物4a處理細(xì)胞48h后htert蛋白的表達(dá)量下降。提示化合物4a對htert蛋白以及端粒酶活性具有較強(qiáng)的抑制作用。4.檢測化合物4a對nf-κb/p65信號(hào)通路的影響,檢測p65、il-6以及tnf-α表達(dá)的變化通過q-pcr及westernblot實(shí)驗(yàn),發(fā)現(xiàn)化合物4a對smmc-7721肝癌細(xì)胞中nf-κb信號(hào)通路中關(guān)鍵分子p65的蛋白表達(dá)及其下游的信號(hào)分子如il-6和tnf-αmrna和蛋白的表達(dá)具有下調(diào)作用,這提示化合物4a抑制smmc-7721細(xì)胞增殖作用可能與nf-κb/p65信號(hào)通路有關(guān)。5.過表達(dá)htert,檢測化合物4a對nf-κb/p65信號(hào)通路中p65、il-6、tnf-α的影響。wersternblot以及q-pcr實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn),過表達(dá)組p65蛋白表達(dá)以及il-6和tnf-αmrna和蛋白的表達(dá)量明顯增多,用化合物4a處理48h后表達(dá)量明顯下降,這提示人肝癌細(xì)胞株smmc-7721中隨著htert表達(dá)量的升高,p65蛋白表達(dá)以及il-6和tnf-αmrna和蛋白的表達(dá)水平明顯上調(diào),同時(shí)化合物4a對p65蛋白表達(dá)以及il-6和tnf-αmrna和蛋白的表達(dá)水平具有明顯下調(diào)的作用。該結(jié)果進(jìn)一步提示通過作用于htert,化合物4a對下游nf-κb/p65信號(hào)通路產(chǎn)生作用從而抑制smmc-7721肝癌細(xì)胞增殖。綜上所述,本課題組以分子對接模型篩選出的靶向hTERT的高活性骨架結(jié)構(gòu)——N-砜基-芳基二氫吡唑?yàn)榛A(chǔ),設(shè)計(jì)、合成了一系列新型二氫吡唑類化合物,同時(shí)通過藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)方法篩選出了一個(gè)潛在的小分子抑制劑——化合物4a,并對其可能的藥理學(xué)作用機(jī)制進(jìn)一步研究探討。一系列實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)通過靶向hTERT抑制端粒酶活性,化合物4a將SMMC-7721肝癌細(xì)胞阻滯于S期,實(shí)現(xiàn)抑制細(xì)胞增殖的目的。同時(shí)發(fā)現(xiàn)這種作用的實(shí)現(xiàn)可能和細(xì)胞增殖活化相關(guān)的NF-κb/P65經(jīng)典信號(hào)通路的下調(diào)密切相關(guān)。
【關(guān)鍵詞】：人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶hTERT SMMC-7721細(xì)胞 二氫吡唑類 抑制增殖 NF-κb P65信號(hào)通路
【學(xué)位授予單位】：安徽醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R914.5;R91
【目錄】：

• 中英文縮略詞對照6-7
• 中文摘要7-10
• 英文摘要10-13
• 1.前言13-15
• 2.實(shí)驗(yàn)材料15-18
• 2.1 腫瘤細(xì)胞株15
• 2.2 藥物與試劑15-16
• 2.3 主要溶液配制16-18
• 2.4 儀器與設(shè)備18
• 2.5 圖像軟件分析18
• 3.實(shí)驗(yàn)方法18-28
• 3.1 細(xì)胞培養(yǎng)18-19
• 3.2 MTT實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞的增殖19-20
• 3.3 改良的TRAP法檢測端粒酶活性20-21
• 3.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期21
• 3.5 Q-PCR方法檢測腫瘤細(xì)胞中mRNA的表達(dá)水平21-24
• 3.5.1 細(xì)胞總RNA提取22
• 3.5.2 RNA的定量22
• 3.5.3 逆轉(zhuǎn)錄過程22-23
• 3.5.4 Q-PCR反應(yīng)23-24
• 3.6 Western-blot方法檢測腫瘤細(xì)胞中蛋白的表達(dá)24-26
• 3.6.1 細(xì)胞蛋白的提取24
• 3.6.2 BCA法蛋白定量24-25
• 3.6.3 SDS-PAGE凝膠電泳法25
• 3.6.4 電轉(zhuǎn)移25-26
• 3.6.5 免疫印跡26
• 3.6.6 凝膠圖象分析26
• 3.7 pCI-neo-hTERT質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染進(jìn)入SMMC-7721肝癌細(xì)胞26-28
• 3.7.1 抽提質(zhì)粒26-27
• 3.7.2 pCI-neo-hTERT質(zhì)粒轉(zhuǎn)染27-28
• 4.數(shù)據(jù)處理28
• 5.實(shí)驗(yàn)結(jié)果28-42
• 5.1 小分子化合物的設(shè)計(jì)思路和合成28-34
• 5.1.1 小分子化合物的設(shè)計(jì)思路28-29
• 5.1.2 小分子化合物的合成29-30
• 5.1.3 目標(biāo)化合物的結(jié)構(gòu)表征及原始圖譜30-34
• 5.2 抗癌活性的篩選34-35
• 5.3 化合物 4a對人肝癌細(xì)胞株SMMC-7721細(xì)胞周期的影響35-37
• 5.4 化合物 4a對hTERT的作用研究37-39
• 5.4.1 計(jì)算機(jī)輔助藥物分子模型設(shè)計(jì)37
• 5.4.2 化合物 4a對端粒酶活性的影響37-38
• 5.4.3 化合物 4a對hTERT的蛋白水平的影響38-39
• 5.5 化合物 4a抑制人肝癌細(xì)胞株SMMC-7721細(xì)胞中P65、IL-6 以及TNF-a的表達(dá)39-40
• 5.6 化合物 4a調(diào)控hTERT對人肝癌細(xì)胞株SMMC-7721中NF-κb/P65信號(hào)通路的影響40-42
• 6.討論42-45
• 7.小結(jié)45-46
• 8 參考文獻(xiàn)46-49
• 個(gè)人簡歷49-52
• 致謝52-54
• 綜述54-67
• 參考文獻(xiàn)63-67

【相似文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 葉正青;梁重峰;丁海;易永祥;張繼宗;劉俊卯;;參麥注射液對人肝癌SMMC-7721腫瘤細(xì)胞的作用[J];江蘇醫(yī)藥;2009年06期

2 劉婉華;劉健;刁振琦;寧皓;李云濤;;兩種卟啉類光敏劑對SMMC-7721細(xì)胞敏化損傷的拉曼光譜分析[J];激光與紅外;2010年06期

3 李憶東;劉宇健;盧建;;地塞米松對人肝癌細(xì)胞系SMMC-7721細(xì)胞酪氨酸轉(zhuǎn)氨酶活性誘導(dǎo)能力喪失的機(jī)制研究[J];第二軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào);2008年06期

4 郭園園;劉玉欣;王艷平;張學(xué)敏;;(順)-3-(氯代亞甲基)-6-甲基-硫色滿-4-酮對SMMC-7721細(xì)胞抑制作用及對Bcl-2/Bax表達(dá)的影響[J];科技創(chuàng)新導(dǎo)報(bào);2013年31期

5 付玉榮;邱宗蔭;顏玉蓉;;羥基喜樹堿誘導(dǎo)SMMC-7721細(xì)胞凋亡時(shí)線粒體凋亡誘導(dǎo)因子的轉(zhuǎn)位研究[J];中華肝臟病雜志;2006年04期

6 俞發(fā)榮;謝明仁;石軍年;;甘肅貓兒眼多糖對SMMC-7721細(xì)胞毒性機(jī)制研究[J];甘肅科學(xué)學(xué)報(bào);2006年04期

7 華瓊;華海清;楊愛珍;秦叔逵;;奧沙利鉑和人參皂苷Rg3不同聯(lián)合方式對人肝癌細(xì)胞株SMMC-7721作用的影響[J];臨床腫瘤學(xué)雜志;2013年02期

8 陸峰,陸國浩,曹永兵,肖振宇,吳玉田;FTIR方法研究若干味中藥對SMMC-7721肝癌細(xì)胞的作用[J];第二軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào);2004年10期

9 皇甫超申;耿旭;谷敬麗;劉彬;;苦參堿誘導(dǎo)SMMC-7721細(xì)胞分化過程中細(xì)胞骨架的改變[J];河南大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版);2006年02期

10 徐乃玉;張素萍;童建;;順鉑處理肝癌細(xì)胞SMMC-7721的蛋白質(zhì)組學(xué)分析[J];中國醫(yī)院藥學(xué)雜志;2008年15期

中國碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前4條

1 何旭;以hT ERT為靶點(diǎn)設(shè)計(jì)合成的新型二氫吡唑類化合物抑制人肝癌細(xì)胞株SMMC-7721增殖的作用機(jī)制研究[D];安徽醫(yī)科大學(xué);2015年

2 陳廣偉;神經(jīng)鞘磷脂合成酶基因沉默對SMMC-7721細(xì)胞凋亡的影響（血清SM、CETP和PLTP對2型糖尿病形成的作用）[D];河南大學(xué);2012年

3 唐筱璐;仙鶴草誘導(dǎo)人肝癌細(xì)胞株SMMC-7721凋亡及對bcl-2、NF-kB（p65）的影響[D];成都中醫(yī)藥大學(xué);2009年

4 賈志強(qiáng);異牛肝菌素對人肝癌細(xì)胞SMMC-7721的增殖抑制和誘導(dǎo)凋亡的分子機(jī)制研究[D];河北醫(yī)科大學(xué);2014年

  本文關(guān)鍵詞：以hT ERT為靶點(diǎn)設(shè)計(jì)合成的新型二氫吡唑類化合物抑制人肝癌細(xì)胞株SMMC-7721增殖的作用機(jī)制研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

，

本文編號(hào)：389252