本文關(guān)鍵詞：基于HIV-1 MPER的抗菌肽設(shè)計(jì)及抗菌機(jī)理研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目前,由于傳統(tǒng)抗生素的廣泛應(yīng)用,導(dǎo)致耐藥菌株的出現(xiàn),這給人類的健康帶來(lái)極大的威脅,使得研制一種新型的具有廣譜抗菌活性的抗菌藥物來(lái)替代傳統(tǒng)的抗生素,成為一項(xiàng)迫切的任務(wù)�？咕氖巧矬w先天性免疫應(yīng)答的重要組成部分,在生物體抵御外來(lái)病原微生物入侵時(shí)發(fā)揮著重要的作用。與傳統(tǒng)的抗生素相比,抗菌肽具有廣譜的抗菌活性、分子量小、細(xì)胞毒性低、熱穩(wěn)定性好及不易產(chǎn)生耐藥性等優(yōu)點(diǎn)。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道,HIV-1的胞外近膜區(qū)域(MPER:Ac-665WASLWNWFNITNW LWYIK683-NH2)具有膜擾亂的活性,而一種來(lái)源于牛嗜中性粒細(xì)胞的天然抗菌肽Indolicidin和MPER類似,也具有膜擾亂的活性并且含有較高比例的色氨酸�；诖�,我們認(rèn)為有膜擾亂活性的HIV-1MPER或其上的某一肽段也可能具有潛在的抗菌活性。在抗菌肽序列篩選過(guò)程中,基于分子量因素、中和抗體4E10識(shí)別表位因素及高比例色氨酸含量導(dǎo)致紅細(xì)胞溶血因素,我們選擇HIV-1 MPER上的4E10中和抗體識(shí)別表位(NWFNITNWLWYIK)用于抗菌肽研究實(shí)驗(yàn)。雖然抗菌肽的氨基酸序列組成多種多樣,但是某些特定的氨基酸,比如賴氨酸和精氨酸是抗菌肽的重要組成部分,并且富含賴氨酸的抗菌肽更易表現(xiàn)出快速的、廣譜的抗菌活性,而且不易產(chǎn)生溶血活性。為了使設(shè)計(jì)的抗菌肽具有這一特性,我們?cè)?E10表位的C-末端添加了三個(gè)賴氨酸殘基(NWFNITNWLWYIKKKK),以增加多肽的正電性和水溶性,并將其命名為AP16。在AP16抗菌活性研究中,通過(guò)對(duì)革蘭氏陰性菌株大腸桿菌(E.coli DH5α)、革蘭氏陽(yáng)性菌株枯草桿菌(B.subtilis ATCC 6633)和表皮葡萄球菌(S.epidermidis ATCC 12228)最小殺菌濃度(MBC)的檢測(cè),我們確定了AP16對(duì)表皮葡萄球菌[MBC:256μg/m L(115.07μM)]有抗菌活性,及對(duì)枯草桿菌[MBC:32μg/mL(14.38μM)]的抗菌活性較好,而AP16對(duì)大腸桿菌沒(méi)有明顯的抗菌活性�；讷@得的AP16初步抗菌活性結(jié)果,我們通過(guò)氨基酸突變或增加序列中堿性氨基酸的數(shù)目來(lái)增強(qiáng)AP16的抗菌活性。與AP16相比,其衍生抗菌肽AP16-A對(duì)大腸桿菌的MBC值為16μg/mL(7.34μM),對(duì)枯草桿菌的MBC值[4μg/mL(1.834μM)]提高了8倍,對(duì)表皮葡萄球菌的MBC值[8μg/mL(3.67μM)]提高了32倍。通過(guò)體內(nèi)和體外的抗菌肽細(xì)胞毒性檢測(cè),AP16-A對(duì)哺乳動(dòng)物細(xì)胞和紅細(xì)胞沒(méi)有明顯的細(xì)胞毒性。在多肽穩(wěn)定性檢測(cè)中,AP16-A在37℃下的穩(wěn)定好,經(jīng)過(guò)15天的熱處理后,仍有抗菌活性,并且最小殺菌濃度沒(méi)有改變。通過(guò)NPN吸收實(shí)驗(yàn)和脂多糖(LPS)結(jié)合實(shí)驗(yàn),我們提出并驗(yàn)證了抗菌肽AP16-A能夠與LPS相互作用并透化革蘭氏陰性菌外膜的抗菌機(jī)理。并通過(guò)殺菌動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)、激光共聚焦顯微鏡觀察、SYTOX Green吸收實(shí)驗(yàn)和凝膠阻滯實(shí)驗(yàn),證明AP16-A對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌和革蘭氏陰性菌抗菌機(jī)理的不同,即AP16-A能夠快速的透化革蘭氏陽(yáng)性菌細(xì)胞膜并產(chǎn)生較快的殺菌動(dòng)力學(xué),而透化革蘭氏陰性菌細(xì)胞膜速度較慢并與胞內(nèi)的物質(zhì)相互作用,從而產(chǎn)生相對(duì)較慢的殺菌動(dòng)力學(xué)。綜上所述,本研究篩選并合成具有良好抗菌活性的抗菌肽AP16-A及驗(yàn)證其潛在的抗菌機(jī)理。AP16-A可以作為一種抗菌肽用于進(jìn)一步的研究。
【關(guān)鍵詞】：抗菌肽 抗菌活性 殺菌動(dòng)力學(xué) 透化細(xì)胞膜 DNA結(jié)合 LPS結(jié)合
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R91;R96
【目錄】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-8
• 縮略詞表8-13
• 第一章 緒論13-28
• 1.1 抗菌肽概述13
• 1.2 抗菌肽的生物活性13-16
• 1.2.1 抗細(xì)菌活性13-14
• 1.2.2 抗真菌活性14
• 1.2.3 抗寄生蟲(chóng)活性14-15
• 1.2.4 抗病毒活性15
• 1.2.5 抗癌細(xì)胞活性15
• 1.2.6 免疫調(diào)節(jié)活性15-16
• 1.3 抗菌肽的來(lái)源16
• 1.4 抗菌肽的分類16-18
• 1.4.1 α-螺旋結(jié)構(gòu)抗菌肽16-17
• 1.4.2 β-折疊結(jié)構(gòu)抗菌肽17
• 1.4.3 無(wú)規(guī)則結(jié)構(gòu)抗菌肽17
• 1.4.4 環(huán)狀結(jié)構(gòu)抗菌肽17-18
• 1.5 抗菌肽序列中特殊氨基酸殘基的結(jié)構(gòu)性質(zhì)18-20
• 1.5.1 賴氨酸（Lys，K）和精氨酸（Arg，，R）18-19
• 1.5.2 色氨酸（Trp,W）19
• 1.5.3 半胱氨酸（Cys,C）和二硫鍵19-20
• 1.5.4 脯氨酸（Pro,P）20
• 1.6 抗菌肽的作用機(jī)制20-25
• 1.6.1 抗菌肽的細(xì)胞選擇性20-21
• 1.6.2 抗菌肽對(duì)細(xì)菌的作用機(jī)制21-25
• 1.7 HIV的胞外近膜區(qū)域（MPER）25-26
• 1.8 立題依據(jù)和實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)26-28
• 第二章 實(shí)驗(yàn)材料與方法28-41
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料28-32
• 2.1.1 多肽合成28
• 2.1.2 質(zhì)粒、細(xì)胞和細(xì)菌28-29
• 2.1.3 主要試劑和材料29-30
• 2.1.4 主要儀器30
• 2.1.5 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物30
• 2.1.6 試劑配制30-32
• 2.2 實(shí)驗(yàn)方法32-41
• 2.2.1 多肽配制32
• 2.2.2 多肽的最小殺菌濃度檢測(cè)32-33
• 2.2.3 AP16-A的質(zhì)量表征33
• 2.2.4 AP16-A和蜂毒肽的抗菌活性比較33-34
• 2.2.5 毒性檢測(cè)34-36
• 2.2.6 37℃條件下AP16-A的穩(wěn)定性檢測(cè)36
• 2.2.7 AP16-A的殺菌動(dòng)力學(xué)36-37
• 2.2.8 AP16-A殺菌機(jī)理37-41
• 第三章 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論41-57
• 3.1 以HIV-1 MPER為基礎(chǔ)的抗菌肽的設(shè)計(jì)41-42
• 3.2 以AP16為基礎(chǔ)的分子改造42-43
• 3.3 AP16-A的質(zhì)量檢測(cè)43-44
• 3.4 AP16-A和天然抗菌肽Melittin的抗菌活性比較44-46
• 3.5 AP16-A的細(xì)胞毒性研究46-48
• 3.5.1 AP16-A對(duì)hCMEC/D3的細(xì)胞毒性46
• 3.5.2 AP16-A的溶血活性46-47
• 3.5.3 在小鼠體內(nèi)的AP16-A的細(xì)胞毒性47-48
• 3.6 AP16-A的熱穩(wěn)定性檢測(cè)48-50
• 3.7 AP16-A在 1×MBC濃度下的殺菌動(dòng)力學(xué)50-51
• 3.8 AP16-A的殺菌機(jī)理研究51-57
• 3.8.1 AP16-A透化革蘭氏陰性菌的細(xì)胞外膜51-52
• 3.8.2 AP16-A能夠與革蘭氏陰性菌外膜上的LPS結(jié)合52
• 3.8.3 AP16-A作用于菌株的具體位置的確定52-53
• 3.8.4 AP16-A透化細(xì)菌的細(xì)胞膜53-55
• 3.8.5 AP16-A與胞內(nèi)物質(zhì)（DNA）相互作用55-57
• 結(jié)論57-58
• 參考文獻(xiàn)58-69
• 作者簡(jiǎn)介69-70
• 致謝70

【相似文獻(xiàn)】

中國(guó)碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前1條

1 賀曉秋;基于HIV-1 MPER的抗菌肽設(shè)計(jì)及抗菌機(jī)理研究[D];吉林大學(xué);2016年

  本文關(guān)鍵詞：基于HIV-1 MPER的抗菌肽設(shè)計(jì)及抗菌機(jī)理研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號(hào)：388817