本文關鍵詞：基于HIV-1 MPER的抗菌肽設計及抗菌機理研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目前,由于傳統(tǒng)抗生素的廣泛應用,導致耐藥菌株的出現(xiàn),這給人類的健康帶來極大的威脅,使得研制一種新型的具有廣譜抗菌活性的抗菌藥物來替代傳統(tǒng)的抗生素,成為一項迫切的任務�？咕氖巧矬w先天性免疫應答的重要組成部分,在生物體抵御外來病原微生物入侵時發(fā)揮著重要的作用。與傳統(tǒng)的抗生素相比,抗菌肽具有廣譜的抗菌活性、分子量小、細胞毒性低、熱穩(wěn)定性好及不易產(chǎn)生耐藥性等優(yōu)點。據(jù)文獻報道,HIV-1的胞外近膜區(qū)域(MPER:Ac-665WASLWNWFNITNW LWYIK683-NH2)具有膜擾亂的活性,而一種來源于牛嗜中性粒細胞的天然抗菌肽Indolicidin和MPER類似,也具有膜擾亂的活性并且含有較高比例的色氨酸�；诖�,我們認為有膜擾亂活性的HIV-1MPER或其上的某一肽段也可能具有潛在的抗菌活性。在抗菌肽序列篩選過程中,基于分子量因素、中和抗體4E10識別表位因素及高比例色氨酸含量導致紅細胞溶血因素,我們選擇HIV-1 MPER上的4E10中和抗體識別表位(NWFNITNWLWYIK)用于抗菌肽研究實驗。雖然抗菌肽的氨基酸序列組成多種多樣,但是某些特定的氨基酸,比如賴氨酸和精氨酸是抗菌肽的重要組成部分,并且富含賴氨酸的抗菌肽更易表現(xiàn)出快速的、廣譜的抗菌活性,而且不易產(chǎn)生溶血活性。為了使設計的抗菌肽具有這一特性,我們在4E10表位的C-末端添加了三個賴氨酸殘基(NWFNITNWLWYIKKKK),以增加多肽的正電性和水溶性,并將其命名為AP16。在AP16抗菌活性研究中,通過對革蘭氏陰性菌株大腸桿菌(E.coli DH5α)、革蘭氏陽性菌株枯草桿菌(B.subtilis ATCC 6633)和表皮葡萄球菌(S.epidermidis ATCC 12228)最小殺菌濃度(MBC)的檢測,我們確定了AP16對表皮葡萄球菌[MBC:256μg/m L(115.07μM)]有抗菌活性,及對枯草桿菌[MBC:32μg/mL(14.38μM)]的抗菌活性較好,而AP16對大腸桿菌沒有明顯的抗菌活性�；讷@得的AP16初步抗菌活性結果,我們通過氨基酸突變或增加序列中堿性氨基酸的數(shù)目來增強AP16的抗菌活性。與AP16相比,其衍生抗菌肽AP16-A對大腸桿菌的MBC值為16μg/mL(7.34μM),對枯草桿菌的MBC值[4μg/mL(1.834μM)]提高了8倍,對表皮葡萄球菌的MBC值[8μg/mL(3.67μM)]提高了32倍。通過體內(nèi)和體外的抗菌肽細胞毒性檢測,AP16-A對哺乳動物細胞和紅細胞沒有明顯的細胞毒性。在多肽穩(wěn)定性檢測中,AP16-A在37℃下的穩(wěn)定好,經(jīng)過15天的熱處理后,仍有抗菌活性,并且最小殺菌濃度沒有改變。通過NPN吸收實驗和脂多糖(LPS)結合實驗,我們提出并驗證了抗菌肽AP16-A能夠與LPS相互作用并透化革蘭氏陰性菌外膜的抗菌機理。并通過殺菌動力學實驗、激光共聚焦顯微鏡觀察、SYTOX Green吸收實驗和凝膠阻滯實驗,證明AP16-A對革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌抗菌機理的不同,即AP16-A能夠快速的透化革蘭氏陽性菌細胞膜并產(chǎn)生較快的殺菌動力學,而透化革蘭氏陰性菌細胞膜速度較慢并與胞內(nèi)的物質(zhì)相互作用,從而產(chǎn)生相對較慢的殺菌動力學。綜上所述,本研究篩選并合成具有良好抗菌活性的抗菌肽AP16-A及驗證其潛在的抗菌機理。AP16-A可以作為一種抗菌肽用于進一步的研究。
【關鍵詞】：抗菌肽 抗菌活性 殺菌動力學 透化細胞膜 DNA結合 LPS結合
【學位授予單位】：吉林大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R91;R96
【目錄】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-8
• 縮略詞表8-13
• 第一章 緒論13-28
• 1.1 抗菌肽概述13
• 1.2 抗菌肽的生物活性13-16
• 1.2.1 抗細菌活性13-14
• 1.2.2 抗真菌活性14
• 1.2.3 抗寄生蟲活性14-15
• 1.2.4 抗病毒活性15
• 1.2.5 抗癌細胞活性15
• 1.2.6 免疫調(diào)節(jié)活性15-16
• 1.3 抗菌肽的來源16
• 1.4 抗菌肽的分類16-18
• 1.4.1 α-螺旋結構抗菌肽16-17
• 1.4.2 β-折疊結構抗菌肽17
• 1.4.3 無規(guī)則結構抗菌肽17
• 1.4.4 環(huán)狀結構抗菌肽17-18
• 1.5 抗菌肽序列中特殊氨基酸殘基的結構性質(zhì)18-20
• 1.5.1 賴氨酸（Lys，K）和精氨酸（Arg，，R）18-19
• 1.5.2 色氨酸（Trp,W）19
• 1.5.3 半胱氨酸（Cys,C）和二硫鍵19-20
• 1.5.4 脯氨酸（Pro,P）20
• 1.6 抗菌肽的作用機制20-25
• 1.6.1 抗菌肽的細胞選擇性20-21
• 1.6.2 抗菌肽對細菌的作用機制21-25
• 1.7 HIV的胞外近膜區(qū)域（MPER）25-26
• 1.8 立題依據(jù)和實驗設計26-28
• 第二章 實驗材料與方法28-41
• 2.1 實驗材料28-32
• 2.1.1 多肽合成28
• 2.1.2 質(zhì)粒、細胞和細菌28-29
• 2.1.3 主要試劑和材料29-30
• 2.1.4 主要儀器30
• 2.1.5 實驗動物30
• 2.1.6 試劑配制30-32
• 2.2 實驗方法32-41
• 2.2.1 多肽配制32
• 2.2.2 多肽的最小殺菌濃度檢測32-33
• 2.2.3 AP16-A的質(zhì)量表征33
• 2.2.4 AP16-A和蜂毒肽的抗菌活性比較33-34
• 2.2.5 毒性檢測34-36
• 2.2.6 37℃條件下AP16-A的穩(wěn)定性檢測36
• 2.2.7 AP16-A的殺菌動力學36-37
• 2.2.8 AP16-A殺菌機理37-41
• 第三章 實驗結果與討論41-57
• 3.1 以HIV-1 MPER為基礎的抗菌肽的設計41-42
• 3.2 以AP16為基礎的分子改造42-43
• 3.3 AP16-A的質(zhì)量檢測43-44
• 3.4 AP16-A和天然抗菌肽Melittin的抗菌活性比較44-46
• 3.5 AP16-A的細胞毒性研究46-48
• 3.5.1 AP16-A對hCMEC/D3的細胞毒性46
• 3.5.2 AP16-A的溶血活性46-47
• 3.5.3 在小鼠體內(nèi)的AP16-A的細胞毒性47-48
• 3.6 AP16-A的熱穩(wěn)定性檢測48-50
• 3.7 AP16-A在 1×MBC濃度下的殺菌動力學50-51
• 3.8 AP16-A的殺菌機理研究51-57
• 3.8.1 AP16-A透化革蘭氏陰性菌的細胞外膜51-52
• 3.8.2 AP16-A能夠與革蘭氏陰性菌外膜上的LPS結合52
• 3.8.3 AP16-A作用于菌株的具體位置的確定52-53
• 3.8.4 AP16-A透化細菌的細胞膜53-55
• 3.8.5 AP16-A與胞內(nèi)物質(zhì)（DNA）相互作用55-57
• 結論57-58
• 參考文獻58-69
• 作者簡介69-70
• 致謝70

【相似文獻】

中國碩士學位論文全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 賀曉秋;基于HIV-1 MPER的抗菌肽設計及抗菌機理研究[D];吉林大學;2016年

  本文關鍵詞：基于HIV-1 MPER的抗菌肽設計及抗菌機理研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：388817