Bromodomain(BRDs)是一種約含110個(gè)氨基酸的溴蛋白質(zhì)功能結(jié)構(gòu)域,能夠特異性識別乙�；嚢彼岬谋Ｊ氐鞍捉Y(jié)構(gòu)域,參與組蛋白乙�；盘柕膫鬟f,進(jìn)而調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄,人類許多疾病的發(fā)生都與BET蛋白有著密切的關(guān)系。其中溴結(jié)構(gòu)域識別蛋白4(BRD4)通過正性轉(zhuǎn)錄延伸因子調(diào)控轉(zhuǎn)錄延長,是轉(zhuǎn)錄延伸的關(guān)鍵介質(zhì);結(jié)合轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)影響有絲分裂,其表達(dá)失調(diào)與多種癌癥相關(guān)。針對此蛋白的靶向藥物,與乙酰賴氨酸識別序列競爭結(jié)合,可誘發(fā)腫瘤細(xì)胞的凋亡和增殖減緩以達(dá)到抗癌的目的。所以,研究BRD4蛋白質(zhì)的抑制劑成為近年來生物化學(xué)領(lǐng)域的一大熱點(diǎn)。但目前只有少量相關(guān)抑制劑被報(bào)道,且結(jié)構(gòu)類型也比較單一�；谄蔚乃幬镌O(shè)計(jì)(FBDD)是一種將隨機(jī)篩選和基于結(jié)構(gòu)的藥物設(shè)計(jì)結(jié)合的藥物發(fā)現(xiàn)新方法�；谄蔚乃幬镌O(shè)計(jì)已在多個(gè)實(shí)驗(yàn)室中應(yīng)用,并已產(chǎn)生進(jìn)入臨床試驗(yàn)的藥物。生物膜干涉技術(shù)(BLI)是全球增長最快的非標(biāo)記(label-free)檢測技術(shù),可實(shí)時(shí)監(jiān)控整個(gè)分子間的結(jié)合過程,并計(jì)算出分子之間的親和力(KD)、結(jié)合速率(ka)、解離速率(kd)等重要數(shù)據(jù),可提供實(shí)時(shí)的、非標(biāo)記的分子間相互作用及含量檢測信息。本研究利用“基于...

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【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
緒論
    參考文獻(xiàn)
第一部分 實(shí)驗(yàn)材料與儀器
    1. 實(shí)驗(yàn)菌株及質(zhì)粒
    2. 生化試劑及耗材
    3. 工具酶及試劑盒
    4. 實(shí)驗(yàn)儀器設(shè)備
    5. 實(shí)驗(yàn)室常用溶液及配制方法
        5.1 感受態(tài)細(xì)胞制備所需溶液
        5.2 BRD4蛋白表達(dá)所需溶液
        5.3 BRD4蛋白純化緩沖液
        5.4 SDS-PAGE電泳緩沖液
        5.5 蛋白質(zhì)結(jié)晶溶液及優(yōu)化條件
第二部分 實(shí)驗(yàn)方法
    1. 基因克隆
        1.1 確定原核表達(dá)系統(tǒng)及使用菌株和質(zhì)粒
        1.2 蛋白質(zhì)標(biāo)簽的選擇
        1.3 去除蛋白標(biāo)簽
        1.4 構(gòu)建重組表達(dá)載體
        1.5 BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞制備
        1.6 質(zhì)粒轉(zhuǎn)化
        1.7 菌落PCR
        1.8 質(zhì)粒提取與測序
    2. 蛋白質(zhì)的表達(dá)與純化
        2.1 蛋白質(zhì)的表達(dá)
        2.2 細(xì)胞裂解
        2.3 蛋白質(zhì)親和層析純化
        2.4 蛋白質(zhì)酶切
        2.5 蛋白質(zhì)凝膠層析純化
    3. 蛋白質(zhì)的檢測
        3.1 蛋白質(zhì)濃度檢測
        3.2 SDS-PAGE電泳
    4. BRD4活性的測定
    5. 生物膜干涉技術(shù)篩選藥物小分子
    6. 蛋白質(zhì)結(jié)晶、與藥物小分子共晶
        6.1 蛋白質(zhì)晶體的培養(yǎng)
        6.2 蛋白質(zhì)結(jié)晶溶液篩選
        6.3 結(jié)晶條件優(yōu)化
        6.4 蛋白質(zhì)與小分子共結(jié)晶
    7. 數(shù)據(jù)收集和處理
    8. 基于片段的藥物分子設(shè)計(jì)
        8.1 基于片段的藥物設(shè)計(jì)原理
        8.2 活性片段的檢測技術(shù)
        8.3 從片段到先導(dǎo)化合物
    9. 蛋白質(zhì)與改造后的藥物小分子共晶
    參考文獻(xiàn)
第三部分 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析
    1. BRD4基因克隆序列分析及結(jié)果
        1.1 BRD4蛋白序列及密碼子優(yōu)化DNA序列
        1.2 設(shè)計(jì)DNA序列
        1.3 合成質(zhì)粒的酶切驗(yàn)證結(jié)果
        1.4 轉(zhuǎn)化后菌落PCR驗(yàn)證結(jié)果
        1.5 BRD4測序結(jié)果
    2. BRD4的表達(dá)純化
        2.1 鎳親和層析純化結(jié)果
        2.2 凝膠柱層析純化結(jié)果
    3. 蛋白質(zhì)活性檢測
    4. 生物膜干涉技術(shù)篩選藥物小分子
    5. 蛋白質(zhì)結(jié)晶與共晶
        5.1 藥物小分子68/PBN2011592-1對于BRD4蛋白質(zhì)結(jié)晶的作用
        5.2 蛋白質(zhì)晶體
        5.3 衍射數(shù)據(jù)解析結(jié)果
    6. 基于片段的藥物分子設(shè)計(jì)
        6.1 優(yōu)化后的小分子
        6.2 優(yōu)化后的小分子與蛋白質(zhì)結(jié)晶
        6.3 衍射數(shù)據(jù)結(jié)果
總結(jié)與展望
參考文獻(xiàn)
文獻(xiàn)綜述 基于片段的藥物設(shè)計(jì)研究進(jìn)展
    參考文獻(xiàn)
符號及縮略詞表
附錄
攻讀碩士學(xué)位期間取得的學(xué)術(shù)成果
致謝



本文編號：3814078