本文關(guān)鍵詞：雙靶向GMCSF-NgR-PirB核酸疫苗的制備及其對(duì)損傷脊髓的免疫治療作用，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：脊髓損傷(Spinal cord injury,SCI)是發(fā)生在脊髓椎管神經(jīng)元?jiǎng)×业貏?chuàng)傷性損傷導(dǎo)致暫時(shí)或永久性的知覺及運(yùn)動(dòng)功能缺損。成年哺乳動(dòng)物中樞神經(jīng)系統(tǒng)(Central nervous system,CNS)受損后其軸突生長(zhǎng)受到抑制而影響其神經(jīng)再生及功能的自我修復(fù),而外周神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)纖維受損后卻能進(jìn)行自我修復(fù)并恢復(fù)其功能。影響CNS損傷修復(fù)和再生的因素很多,一方面是因?yàn)樯窠?jīng)纖維生長(zhǎng)能力受限、膠質(zhì)瘢痕的形成及神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子缺乏等多種因素致使損傷軸突再生困難;另一方面是由于損傷的中樞微環(huán)境中髓磷脂相關(guān)抑制因子(Myelin associated inhibitors,MAIs)及其受體的大量存在,進(jìn)而介導(dǎo)髓磷脂抑制信號(hào)的傳遞。因此,通過(guò)直接干預(yù)MAIs抑制信號(hào)的傳遞促進(jìn)神經(jīng)再生,可能作為針對(duì)脊髓損傷行之有效的治療方法之一。作為MAIs的共同受體,Nogo受體(Nogo-66 receptor,Ng R)和成對(duì)免疫球蛋白樣受體B(paired immunoglobulin-like receptor B,Pir B)能介導(dǎo)MAIs抑制信號(hào)的傳遞,因此,抑制Ng R和Pir B可能會(huì)促進(jìn)神經(jīng)軸突再生和保護(hù)神經(jīng)元生長(zhǎng)錐完整,進(jìn)而發(fā)揮神經(jīng)再生的促進(jìn)效應(yīng)。核酸疫苗作為一種新的免疫治療策略近年來(lái)已被廣泛應(yīng)用于各種疾病的治療研究,而人GM-CSF具有增強(qiáng)機(jī)體免疫應(yīng)答和促進(jìn)T細(xì)胞增殖的能力,是一種重要細(xì)胞因子佐劑,同時(shí),GM-CSF還具有神經(jīng)保護(hù)作用,可激活神經(jīng)干、祖細(xì)胞且抑制膠質(zhì)瘢痕的形成。為探討GMCSF-Ng R-Pir B核酸疫苗對(duì)損傷脊髓的免疫治療作用,本研究采用基因工程方法分別克隆Ng R、Pir B和GM-CSF基因片段,構(gòu)建pc DNA-GMCSF-Ng R-Pir B真核表達(dá)載體,然后與脂質(zhì)體一起形成復(fù)合核酸疫苗。免疫大鼠后通過(guò)免疫學(xué)、行為學(xué)及組織學(xué)等方法探討GMCSF-Ng R-Pir B核酸疫苗對(duì)損傷脊髓的修復(fù)作用及運(yùn)動(dòng)功能的改善情況,為中樞神經(jīng)軸突再生的免疫治療提供理論依據(jù)和實(shí)踐基礎(chǔ)。主要研究?jī)?nèi)容:1.真核表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定及體外表達(dá)檢測(cè)PCR擴(kuò)增共表達(dá)GM-CSF、Ng R及Pir B目的基因片段,分別亞克隆至pc DNA3.1(+)質(zhì)粒中,構(gòu)建重組真核表達(dá)載體pc DNA-GMCSF-Ng R-Pir B,并進(jìn)行PCR、酶切及基因測(cè)序鑒定。重組質(zhì)粒通過(guò)脂質(zhì)體法體外轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞并用免疫熒光法檢測(cè)Ng R和Pir B蛋白的體外表達(dá)情況。2.制備GMCSF-Ng R-Pir B核酸疫苗將脂質(zhì)體與GMCSF-Ng R-Pir B重組質(zhì)粒以1:1的體積比混合后形成核酸疫苗,以SD大鼠為研究對(duì)象,肌肉注射連續(xù)免疫6w,期間每周檢測(cè)免疫血清中抗體的效價(jià)。同時(shí)觀察動(dòng)物體重及行為學(xué)改變情況,評(píng)價(jià)疫苗免疫能否引起大鼠變態(tài)性腦脊髓炎。3.雙靶向GMCSF-Ng R-Pir B核酸疫苗對(duì)損傷脊髓的免疫治療作用核酸疫苗連續(xù)免疫6w后,制備脊髓左側(cè)半橫切損傷動(dòng)物模型,并分別從行為學(xué)、組織學(xué)及分子水平評(píng)價(jià)GMCSF-Ng R-Pir B核酸疫苗對(duì)軸突再生及運(yùn)動(dòng)功能改善的促進(jìn)作用。主要結(jié)果及結(jié)論:1.成功構(gòu)建了GMCSF、Ng R和Pir B共表達(dá)的真核表達(dá)載體。2.制備了雙靶向GMCSF-Ng R-Pir B核酸疫苗及SD大鼠左側(cè)半橫切脊髓損傷動(dòng)物模型。3.雙靶向GMCSF-Ng R-Pir B核酸疫苗能刺激機(jī)體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生特異性抗體,中和內(nèi)源性Ng R及Pir B,有效逆轉(zhuǎn)中樞神經(jīng)系統(tǒng)Ng R和Pir B介導(dǎo)的髓磷脂再生抑制信號(hào)的傳遞,促進(jìn)受損脊髓神經(jīng)纖維的修復(fù)及運(yùn)動(dòng)功能的改善。
【關(guān)鍵詞】：NgR PirB 核酸疫苗 脊髓損傷 軸突再生
【學(xué)位授予單位】：重慶理工大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R943;R96
【目錄】：

• 摘要4-6
• Abstract6-10
• 英文縮寫標(biāo)注10-12
• 緒論12-18
• 1 核酸疫苗對(duì)脊髓損傷的免疫治療策略12-13
• 2 髓磷脂抑制因子受體-NgR和Pir B13-17
• 2.1 NgR13-14
• 2.2 PirB14-17
• 3 GM-CSF細(xì)胞因子佐劑及其對(duì)中樞神經(jīng)損傷的修復(fù)作用17-18
• 第一章 pcDNA-GMCSF-NgR-PirB真核表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定18-38
• 1 實(shí)驗(yàn)材料18-21
• 1.1 質(zhì)粒載體18
• 1.2 菌株18
• 1.3 引物設(shè)計(jì)合成18-19
• 1.4 細(xì)胞系19
• 1.5 主要實(shí)驗(yàn)儀器19-20
• 1.6 主要試劑20-21
• 1.7 主要試劑配制21
• 2 實(shí)驗(yàn)方法21-30
• 2.1 DH5α感受態(tài)細(xì)胞制備21
• 2.2 雙靶向pcDNA-GMCSF-NgR-PirB真核表達(dá)載體的構(gòu)建21-28
• 2.3 雙靶向pcDNA-GMCSF-NgR-PirB真核表達(dá)載體的鑒定28-30
• 3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果30-36
• 3.1 GMCSF、NgR及PirB目的基因擴(kuò)增30-31
• 3.2 陽(yáng)性克隆鑒定31-35
• 3.3 pcDNA-GMCSF-NgR-PirB重組質(zhì)粒體外表達(dá)檢測(cè)35-36
• 4 小結(jié)36-38
• 第二章 雙靶向GMCSF-NgR-PirB疫苗對(duì)損傷脊髓免疫治療作用38-64
• 1 實(shí)驗(yàn)材料38-41
• 1.1 實(shí)驗(yàn)主要試劑38-39
• 1.2 實(shí)驗(yàn)主要器材39
• 1.3 試劑配制39-40
• 1.4 質(zhì)粒40-41
• 1.5 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物41
• 2 實(shí)驗(yàn)方法41-49
• 2.1 制備雙靶向GMCSF-NgR-PirB核酸疫苗41
• 2.2 雙靶向GMCSF-NgR-PirB核酸疫苗免疫動(dòng)物41-42
• 2.3 雙靶向GMCSF-NgR-PirB核酸疫苗體內(nèi)免疫學(xué)活性檢測(cè)42-43
• 2.4 實(shí)驗(yàn)SD大鼠變態(tài)性腦脊髓炎的發(fā)生率檢測(cè)43
• 2.5 SCI動(dòng)物模型的制備43
• 2.6 GMCSF-NgR-PirB核酸疫苗對(duì)損傷脊髓治療的行為學(xué)評(píng)價(jià)43-44
• 2.7 GMCSF-NgR-PirB核酸疫苗對(duì)損傷脊髓治療的組織學(xué)評(píng)價(jià)44-48
• 2.8 雙靶向GMCSF-NgR-PirB核酸疫苗體內(nèi)質(zhì)粒殘留檢測(cè)48-49
• 2.9 數(shù)據(jù)結(jié)果統(tǒng)計(jì)49
• 3 結(jié)果分析49-63
• 3.1 雙靶向GMCSF-NgR-PirB復(fù)合核酸疫苗免疫產(chǎn)生的抗體效價(jià)49-50
• 3.2 實(shí)驗(yàn)SD大鼠變態(tài)性腦脊髓炎的發(fā)生率檢測(cè)50-51
• 3.3 GMCSF-NgR-PirB核酸疫苗對(duì)損傷脊髓治療的行為學(xué)評(píng)價(jià)51-55
• 3.4 GMCSF-NgR-PirB核酸疫苗對(duì)損傷脊髓治療的組織學(xué)評(píng)價(jià)55-61
• 3.5 雙靶向GMCSF-NgR-PirB核酸疫苗體內(nèi)質(zhì)粒殘留61-63
• 4 小結(jié)63-64
• 討論64-68
• 全文總結(jié)68-70
• 致謝70-72
• 參考文獻(xiàn)72-78
• 個(gè)人簡(jiǎn)歷、在學(xué)期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文及取得的研究成果78-79

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