本文關(guān)鍵詞：替諾福韋酯致PC12細(xì)胞損傷及其機(jī)制研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的:應(yīng)用不同濃度替諾福韋酯(Tenofovir disoproxil fumarate,TDF)作用于體外培養(yǎng)PC12細(xì)胞(pheochromocytoma),觀察替諾福韋酯對(duì)PC12細(xì)胞存活率、凋亡以及相關(guān)指標(biāo)的影響,探討替諾福韋酯對(duì)神經(jīng)細(xì)胞損傷的作用機(jī)制。方法:MTT法檢測(cè)PC12細(xì)胞的生存率;LDH法檢測(cè)替諾福韋酯對(duì)PC12細(xì)胞的損傷作用;Hoechst-33342染色觀察細(xì)胞核凋亡形態(tài)的變化;采用原位末端轉(zhuǎn)移酶標(biāo)記法(TUNEL)和Annexin V-FITC/PI標(biāo)記染色流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)PC12細(xì)胞凋亡率;酶標(biāo)法測(cè)定PC12細(xì)胞內(nèi)丙二醛(MDA)的含量;DCFH-DA染色法檢測(cè)PC12細(xì)胞內(nèi)活性氧(ROS)水平;Western-blot法檢測(cè)細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白Bax表達(dá)量的改變。結(jié)果:替諾福韋酯處理PC12細(xì)胞濃度為0μmol/L(對(duì)照組)、25μmol/L、50μmol/L、100μmol/L、200μmol/L和400μmol/L時(shí),細(xì)胞存活率分別是100±3.07%、97.29±1.74%、99.08±1.54%、92.47±0.81%、81.86±2.53%和48.74±4.65%,其中替諾福韋酯濃度達(dá)到100μmol/L時(shí),較對(duì)照組降低,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),當(dāng)替諾福韋酯濃度達(dá)到200μmol/L和400μmol/L時(shí),較對(duì)照組降低,有顯著性差異(P0.01),提示替諾福韋酯對(duì)PC12細(xì)胞生長(zhǎng)抑制作用呈濃度依賴性。替諾福韋酯處理PC12細(xì)胞濃度為0μmol/L(對(duì)照組)、25μmol/L、50μmol/L、100μmol/L、200μmol/L和400μmol/L時(shí),細(xì)胞培養(yǎng)液中LDH活性為118.84±17.88、137.87±26.06、144.85±25.26、189.58±24.98、214.51±22.30、262.86±21.71,其中替諾福韋酯濃度達(dá)到100μmol/L時(shí),較對(duì)照組升高,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),當(dāng)替諾福韋酯濃度達(dá)到200μmol/L和400μmol/L時(shí),較對(duì)照組升高,有顯著性差異(P0.01),提示替諾福韋酯對(duì)PC12細(xì)胞的損傷作用呈濃度依賴性。Hoechst-33342染色觀察細(xì)胞核形態(tài)變化結(jié)果顯示,隨著替諾福韋酯濃度增高,顯示凋亡特征的PC12細(xì)胞數(shù)量明顯增加,呈現(xiàn)出不同程度的染色質(zhì)凝聚,核皺縮和凋亡小體形成;TUNEL和Annexin V/PI標(biāo)記染色流式細(xì)胞儀檢測(cè)顯示,替諾福韋酯處理PC12細(xì)胞濃度為0μmol/L(對(duì)照組)、100μmol/L、200μmol/L和400μmol/L時(shí),細(xì)胞凋亡率是1.21±0.45%、11.96±1.64%、33.60±5.87%和51.71±2.50%,其中替諾福韋酯濃度達(dá)到100μmol/L時(shí),較對(duì)照組升高,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);當(dāng)替諾福韋酯濃度達(dá)到200μmol/L和400μmol/L時(shí),較對(duì)照組升高,有顯著性差異(P0.01),提示替諾福韋酯具有誘導(dǎo)PC12細(xì)胞凋亡作用。應(yīng)用高內(nèi)涵活細(xì)胞檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)活性氧的含量變化,替諾福韋酯處理PC12細(xì)胞濃度為0μmol/L(對(duì)照組)、100μmol/L、200μmol/L和400μmol/L時(shí),細(xì)胞內(nèi)ROS的熒光強(qiáng)度為25540.26±2584.27、37264.90±2098.7、68924.21±330.14和92540.88±4545.79,其中替諾福韋酯濃度達(dá)到100μmol/L時(shí),較對(duì)照組升高,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),當(dāng)替諾福韋酯濃度達(dá)到200μmol/L和400μmol/L時(shí),較對(duì)照組升高,有顯著性差異(P0.01);酶標(biāo)法檢測(cè)PC12細(xì)胞丙二醛含量的結(jié)果顯示,替諾福韋酯處理PC12細(xì)胞濃度為0μmol/L(對(duì)照組)、100μmol/L、200μmol/L和400μmol/L時(shí),細(xì)胞內(nèi)丙二醛含量分別為6.64±0.54、8.88±0.78、9.88±0.70和16.22±0.38,其中替諾福韋酯濃度達(dá)到100μmol/L時(shí),較對(duì)照組升高,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),當(dāng)替諾福韋酯濃度達(dá)到200μmol/L和400μmol/L時(shí),較對(duì)照組升高,有顯著性差異(P0.01);Western-blot檢測(cè)結(jié)果顯示,替諾福韋酯處理PC12細(xì)胞濃度為0μmol/L(對(duì)照組)、100μmol/L、200μmol/L和400μmol/L時(shí),細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白Bax相對(duì)表達(dá)量為1.14±0.04、1.28±0.04、1.61±0.06和2.19±0.07,其中替諾福韋酯濃度達(dá)到100μmol/L時(shí),較對(duì)照組升高,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),當(dāng)替諾福韋酯濃度達(dá)到200μmol/L和400μmol/L時(shí),較對(duì)照組升高,有顯著性差異(P0.01),提示替諾福韋酯致PC12細(xì)胞損傷與線粒體凋亡通路有關(guān)。結(jié)論:替諾福韋酯對(duì)PC12細(xì)胞具有損傷作用,與誘導(dǎo)PC12細(xì)胞凋亡有關(guān);凋亡途徑與線粒體凋亡通路有關(guān)。
【關(guān)鍵詞】：替諾福韋酯 PC12細(xì)胞 細(xì)胞凋亡 氧化損傷
【學(xué)位授予單位】：河南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R96
【目錄】：

• 摘要4-6
• ABSTRACT6-11
• 前言11-13
• 1 材料、試劑和儀器13-19
• 1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞株13
• 1.2 試劑13-14
• 1.3 儀器設(shè)備14-15
• 1.4 試劑配制15-19
• 1.4.1 DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基15
• 1.4.2 磷酸鹽緩沖液（Phosphate buffer solution，，PBS）15
• 1.4.3 MTT工作液15
• 1.4.4 胰酶儲(chǔ)備液15
• 1.4.5 胰酶工作液15
• 1.4.6 多聚賴氨酸工作液(PLL)15-16
• 1.4.7 PMSF配制16
• 1.4.8 考馬斯亮藍(lán)G250溶液16
• 1.4.9 SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液16
• 1.4.10 10×電泳緩沖液16
• 1.4.11 1×轉(zhuǎn)移緩沖液16
• 1.4.12 10×麗春紅染液16
• 1.4.13 洗脫抗體緩沖液16-17
• 1.4.14 10×TBS緩沖液17
• 1.4.15 1×TBST緩沖液17
• 1.4.16 封閉緩沖液（5%的脫脂奶粉）17-19
• 2 實(shí)驗(yàn)方法19-25
• 2.1 PC12細(xì)胞培養(yǎng)19
• 2.2 MTT比色法檢測(cè)替諾福韋酯對(duì)PC12細(xì)胞存活率的影響19
• 2.3 酶標(biāo)法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)液LDH的變化19
• 2.4 Hoechst-33342染色觀察細(xì)胞核形態(tài)的變化19-20
• 2.5 TUNEL法檢測(cè)細(xì)胞凋亡率20
• 2.6 Annexin V-FITC/PI染色檢測(cè)細(xì)胞凋亡率20
• 2.7 高內(nèi)涵成像系統(tǒng)檢測(cè)PC12細(xì)胞內(nèi)ROS的含量20
• 2.8 酶標(biāo)法檢測(cè)PC12細(xì)胞內(nèi)丙二醛的含量20-21
• 2.9 Western-blot檢測(cè)PC12細(xì)胞Bax的表達(dá)21-23
• 2.9.1 細(xì)胞總蛋白的提取21
• 2.9.2 BCA試劑盒定量檢測(cè)細(xì)胞總蛋白濃度21-22
• 2.9.3 蛋白變性22
• 2.9.4 Western-blot檢測(cè)22-23
• 2.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理23-25
• 3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果25-33
• 3.1 替諾福韋酯對(duì)PC12細(xì)胞增殖的影響25
• 3.2 LDH法檢測(cè)替諾福韋酯對(duì)PC12細(xì)胞的損傷作用25-26
• 3.3 替諾福韋酯對(duì)PC12細(xì)胞核形態(tài)的影響26-27
• 3.4 Tunel法觀察替諾福韋酯對(duì)PC12細(xì)胞凋亡率的影響27-28
• 3.5 Annexin V-FITC/PI染色流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)替諾福韋酯對(duì)PC12細(xì)胞凋亡的影響28-29
• 3.6 PC12細(xì)胞內(nèi)ROS含量測(cè)定29-30
• 3.7 PC12細(xì)胞內(nèi)丙二醛含量測(cè)定30
• 3.8 替諾福韋酯對(duì)PC12細(xì)胞凋亡蛋白Bax表達(dá)的影響30-33
• 4 討論33-35
• 5 結(jié)論35-37
• 參考文獻(xiàn)37-39
• 文獻(xiàn)綜述39-49
• 參考文獻(xiàn)45-49
• 附錄49-51
• 致謝51-53
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文53-54

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本文編號(hào)：336932