本文關(guān)鍵詞：丙泊酚及右美托咪定對體外培養(yǎng)海馬神經(jīng)元的影響及機制研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：第一部分原代乳鼠海馬神經(jīng)元的培養(yǎng)、形態(tài)學(xué)觀察及純度鑒定目的:1培養(yǎng)新生SD乳鼠海馬神經(jīng)元,掌握大鼠海馬神經(jīng)元的體外培養(yǎng)技術(shù);2觀察不同階段的原代海馬神經(jīng)元的形態(tài)學(xué)特點;3利用免疫熒光細胞化學(xué)方法鑒定神經(jīng)元純度。方法:取新生24 h內(nèi)的SD乳鼠,用碘酊和75%乙醇消毒,剪斷頭,分層剪開皮膚和顱骨,用彎鑷取出大腦,置于預(yù)冷的DMEM液中,快速剝離出兩側(cè)海馬組織,在解剖顯微鏡下去除海馬的血管和被膜,把海馬移入含有木瓜酶的DMEM中,置于37°C,5%CO2培養(yǎng)箱中消化30 min。用吸管將組織塊移入含有10%血清的DMEM液中終止消化2 min。然后把組織塊移入含有血清的DMEM液中,用維納斯剪剪碎,用槍頭輕輕吹打三到五次,然后過200目細胞篩。取0.9 ml按臺盼藍拒染法進行活細胞計數(shù),制成1×106/ml密度的細胞懸液,種植于Matrigel基膜包被的24孔培養(yǎng)板中,每孔加500μl,置于37°C,5%CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。6 h后全量換無血清Neurobasal培養(yǎng)基。第48 h時加入終濃度為10μmol/L的阿糖胞苷,以抑制非神經(jīng)元細胞的過度生長。每2天半量換液,并在顯微鏡下觀察神經(jīng)元的生長情況。神經(jīng)元培養(yǎng)6 d后,應(yīng)用免疫熒光化學(xué)技術(shù),用不同的熒光標記分別顯示神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細胞。熒光顯微鏡下觀察,拍照。隨機選取3個孔,在高倍視野(10×20倍)下隨機選取3個視野,計數(shù)神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細胞及所有細胞核的數(shù)目,計算神經(jīng)元所占的百分比,取均值作為每孔神經(jīng)元純度。結(jié)果:1體外培養(yǎng)的原代SD乳鼠海馬神經(jīng)元,形態(tài)典型,突起連接成網(wǎng),生長狀態(tài)良好;2體外培養(yǎng)的原代海馬神經(jīng)元細胞核染色清晰,海馬神經(jīng)元純度為(94.81±1.90)%,組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.81)。結(jié)論:體外培養(yǎng)的原代SD新生乳鼠海馬神經(jīng)元形態(tài)典型,純度在90%以上,能夠滿足進一步的實驗要求。第二部分丙泊酚及右美托咪定對發(fā)育期海馬神經(jīng)元突起及突觸影響目的:探討丙泊酚及右美托咪定是否會對原代培養(yǎng)的發(fā)育期SD乳鼠海馬神經(jīng)元突起及突觸的發(fā)育產(chǎn)生影響。方法:取原代培養(yǎng)第6 d的海馬神經(jīng)元,隨機分為5組:空白對照組(C組)、丙泊酚溶劑對照組(F組)、丙泊酚組(P組)、右美托咪定組(D組)、丙泊酚加右美托咪定組(PD組)。于培養(yǎng)第6天,P組加入丙泊酚,使其終濃度為100μmol/L;F組加入等體積的丙泊酚溶劑;D組加入生理鹽水稀釋的右美托咪定,使其終濃度為100 nmol/L,PD組加入右美托咪定和丙泊酚,使其終濃度分別為100 nmol/L和100μmol/L;C組加入等體積的生理鹽水。繼續(xù)培養(yǎng)8h后,為各組神經(jīng)元全量換液,并用PBS清洗2次,加入培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24h,隨機選取視野為神經(jīng)元拍照。所得照片用Motic Med 6.0軟件處理,使用其測量長度工具測量視野內(nèi)軸突和樹突的總長度,計數(shù)該視野神經(jīng)元總數(shù),以該視野神經(jīng)元平均突起總長度作為統(tǒng)計指標。用免疫熒光化學(xué)法測定各組神經(jīng)元突觸素的含量,采集突觸素熒光圖像,用Image-Pro Plus 6.0軟件分析各組突觸素的平均熒光密度(MOD,mean optical density)。結(jié)果:1神經(jīng)元平均突起總長度:P組及PD組與C組比較,數(shù)值有所降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05);PD組與P組比較,數(shù)值有所升高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05);F組及D組與C組比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義。2突觸素的平均熒光密度值(MOD):P組及PD組與C組比較,數(shù)值有所降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05);PD組與P組比較,數(shù)值有所升高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05);F組及D組與C組比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)論:1丙泊酚影響原代培養(yǎng)的乳鼠海馬神經(jīng)元突起及突觸的發(fā)育;2右美托咪定減少丙泊酚對原代培養(yǎng)乳鼠海馬神經(jīng)元突起及突觸發(fā)育的影響。第三部分丙泊酚及右美托咪定對發(fā)育期海馬神經(jīng)元影響的可能機制目的:探討丙泊酚及右美托咪定對發(fā)育期海馬神經(jīng)元影響的可能分子機制。方法:取原代培養(yǎng)第6 d的海馬神經(jīng)元,隨機分為6組:空白對照組(C組)、丙泊酚溶劑對照組(F組)、丙泊酚組(P組)、右美托咪定組(D組)、丙泊酚加右美托咪定組(PD組)、育亨賓組(Y組)。于培養(yǎng)第5天,P組加入丙泊酚,使其終濃度為100μmol/L;F組加入等體積的丙泊酚溶劑;D組加入生理鹽水稀釋的右美托咪定,使其終濃度為100 nmol/L,PD組加入右美托咪定和丙泊酚,使其終濃度分別為100 nmol/L和100μmol/L;Y組先加入育亨賓,使其終濃度為2μmol/L,再加入右美托咪定和丙泊酚,終濃度同PD組;C組加入等體積的生理鹽水。繼續(xù)培養(yǎng)8h后,為各組神經(jīng)元全量換液,并用PBS清洗2次,加入培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24h,棄去培養(yǎng)基,用PBS清洗兩次,收集每組細胞,利用Western Blot技術(shù)分析各組腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF,brain-derived neurotrophic factor)及其特異性受體Trk B和坍塌反應(yīng)調(diào)節(jié)蛋白2(CRMP-2,collapsin response mediator protein-2)表達的改變。利用Gel Image Analysis V 2.02軟件分析各條帶的灰度值,BDNF,Trk B和CRMP-2蛋白的相對量分別以BDNF,Trk B和CRMP-2條帶的灰度值與內(nèi)參β-actin條帶灰度值的比值表示。結(jié)果:1 BDNF:P組及PD組與C組比較,數(shù)值有所降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05);PD組與P組比較,數(shù)值有所升高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05);Y組與P組比較,數(shù)值有所降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05);F組及D組與C組比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義。2 Trk B:P組、PD組及D組與C組比較,數(shù)值有所降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05);PD組及D組與P組比較,數(shù)值有所升高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05);Y組與P組比較,數(shù)值有所降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05);F組與C組比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義。3 CRMP-2:P組及PD組與C組比較,數(shù)值有所降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05);與P組比較,PD組、Y組數(shù)值有所升高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05);F組及D組與C組比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)論:1丙泊酚減少體外培養(yǎng)海馬神經(jīng)元BDNF,Trk B和CRMP-2的表達可能是丙泊酚影響海馬神經(jīng)元突起及突觸發(fā)育的分子機制之一;2右美托咪定使丙泊酚孵育的體外培養(yǎng)海馬神經(jīng)元中BDNF,Trk B和CRMP-2的表達增加,可能是右美托咪定能減少丙泊酚對體外培養(yǎng)海馬神經(jīng)元突起及突觸發(fā)育影響的可能分子機制之一。
【關(guān)鍵詞】：海馬神經(jīng)元 原代培養(yǎng) MAP2 GFAP 純度鑒定 海馬神經(jīng)元 原代培養(yǎng) 丙泊酚 右美托咪定 突起 突觸素 丙泊酚 右美托咪定 BDNF Trk B CRMP-2
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R96
【目錄】：

• 中文摘要5-9
• 英文摘要9-13
• 英文縮寫13-14
• 引言14-15
• 第一部分 原代乳鼠海馬神經(jīng)元的培養(yǎng)、形態(tài)學(xué)觀察及純度鑒定15-26
• 前言15
• 材料與方法15-19
• 結(jié)果19-21
• 附圖21-23
• 討論23-24
• 小結(jié)24
• 參考文獻24-26
• 第二部分 丙泊酚及右美托咪定對發(fā)育期海馬神經(jīng)元突起及突觸的影響26-34
• 前言26
• 材料與方法26-28
• 結(jié)果28-30
• 附表30-31
• 討論31-32
• 小結(jié)32
• 參考文獻32-34
• 第三部分 丙泊酚及右美托咪定對發(fā)育期海馬神經(jīng)元影響的可能機制34-44
• 前言34
• 材料與方法34-38
• 結(jié)果38-39
• 附圖39-40
• 附表40-41
• 討論41-42
• 小結(jié)42-43
• 參考文獻43-44
• 結(jié)論44-45
• 綜述 右美托咪定通過星形膠質(zhì)細胞起的神經(jīng)保護作用的研究45-53
• 參考文獻49-53
• 致謝53-54
• 個人簡歷54

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前6條

1 周寧;陳春龍;高珊;高獻忠;劉清珍;劉健;嵇晴;李偉彥;;右美托咪定預(yù)防嗎啡耐受及其對脊髓內(nèi)膠質(zhì)細胞和ERK的影響[J];中國藥理學(xué)通報;2014年01期

2 劉付寧;紀風(fēng)濤;何惠燕;梁建軍;劉玲;曹銘輝;;右美托咪定對大鼠腦缺血再灌注損傷后星形膠質(zhì)細胞的影響[J];中國病理生理雜志;2012年10期

3 黃立寧;韓建民;劉雅;劉悅;曹翠麗;;新生大鼠海馬神經(jīng)元原代無血清培養(yǎng)與鑒定[J];基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床;2012年01期

4 劉佩;劉U

本文編號：325110