本文關(guān)鍵詞：蛋白質(zhì)O-GlcNAc糖基化在紫杉醇抗腫瘤活性中的作用研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：O-GlcNAc糖基化修飾是指單個的N-乙酰葡萄糖胺(N-acetylglucosamine, GlcNAc)以O(shè)-糖苷鍵連接在蛋白質(zhì)的絲氨酸或蘇氨酸的羥基的氧原子上。美國生物化學家Gerald W. Hart教授課題組1984年首次發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)的O-GlcNAc單糖基化修飾現(xiàn)象。近30年的研究發(fā)現(xiàn),O-GlcNAc糖基化廣泛參與基因轉(zhuǎn)錄、蛋白翻譯及加工、信號傳導、細胞應(yīng)激反應(yīng)等細胞內(nèi)生命活動的調(diào)控。O-GlcNAc糖基化的異常修飾可以導致多種疾病,比如腫瘤、糖尿病及多種神經(jīng)退行性疾病等的發(fā)生。而我們在研究紫杉醇抗腫瘤過程中發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)的O-GlcNAc糖基化水平發(fā)生明顯的改變而且變化呈現(xiàn)一定的規(guī)律性。因此,本論文研究蛋白質(zhì)的O-GlcNAc糖基化修飾在紫杉醇抗腫瘤活性中的作用。本課題主要通過體內(nèi)和體外實驗,從動物組織和細胞水平上分析紫杉醇對蛋白質(zhì)O-GlcNAc糖基化修飾水平的影響,通過運用OGA和OGT的抑制劑研究O-GlcNAc糖基化變化對紫杉醇抗腫瘤活性的影響,并通過對O-GlcNAc糖基化生物合成途徑中的相關(guān)酶的影響來分析探討其機制。此外,本課題還通過質(zhì)譜分析的方法對糖酵解過程中兩個關(guān)鍵酶己糖激酶2型(HK2)和丙酮酸激酶M2型(PKM2)的O-GlcNAc糖基化位點進行了鑒定,運用細胞穩(wěn)定轉(zhuǎn)染方法構(gòu)建HK2和PKM2基因穩(wěn)定高表達細胞株,構(gòu)建HK2和PKM2基因沉默的乳腺癌MDA-MB-231細胞株,為進一步深入研究O-GlcNAc糖基化修飾的功能作用奠定基礎(chǔ)。在體外細胞實驗中,通過Western blotting方法檢測不同濃度的紫杉醇對乳腺癌MDA-MB-231細胞中蛋白質(zhì)O-GlcNAc糖基化及相關(guān)蛋白酶的表達水平,發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)O-GlcNAc糖基化、OGA及OGT的表達水平隨著紫杉醇濃度的升高而升高,具有濃度依賴性關(guān)系,而相關(guān)的蛋白酶PFK1、HK2、PKM2、GFAT1和GLUT1表達水平無明顯變化；通過RT-qPCR法檢測發(fā)現(xiàn)OGT和OGA的mRNA表達水平也隨著紫杉醇濃度的增加而升高,具有濃度依賴性關(guān)系。Western blotting法檢測紫杉醇處理MDA-MB-231細胞在不同時間點的蛋白質(zhì)O-GlcNAc糖基化及相關(guān)蛋白酶的表達水平,發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)O-GlcNAc糖基化修飾、OGA、OGT的表達水平隨著紫杉醇作用時間的增加而升高而且呈現(xiàn)時間依賴性,而相關(guān)的蛋白酶PFK1、PKM2、GFAT1和GLUT1表達水平無明顯變化�；酋Ａ_丹明B (sulforhodamine B, SRB)比色法測定OGA抑制劑TMG或PUGNAc單獨或聯(lián)合紫杉醇對乳腺癌MDA-MB-231細胞的增值抑制作用,實驗結(jié)果表明TMG及PUGNAc對乳腺癌細胞MDA-MB-231無顯著的增值抑制作用,TMG或PUGNAc與紫杉醇聯(lián)合使用對細胞的增值抑制作用與紫杉醇單獨處理組無明顯的差異；Western blotting研究發(fā)現(xiàn)TMG或P UGNAc實驗組O-GlcNAc糖基化水平比對照組高,TMG或PUGNAc與紫杉醇聯(lián)合用藥組的O-GlcNAc糖基化水平比紫杉醇單獨給藥組高,但OGT的表達水平卻無明顯變化規(guī)律。由TMG或PUGNAc對紫杉醇的細胞增殖抑制實驗結(jié)果表明TMG或PUGNAc所引起的O-GlcNAc糖基化水平的增高不影響紫杉醇對細胞的增殖抑制作用。OGT的抑制劑alloxan與紫杉醇單獨或聯(lián)合處理MDA-MB-231細胞時,SRB結(jié)果顯不alloxan濃度為0-5 mM時對乳腺癌細胞MDA-MB-231無明顯的增殖抑制作用,alloxan與紫杉醇聯(lián)合使用組對細胞的增值抑制作用與紫杉醇單獨加藥組相比無明顯差異；Western blotting檢測發(fā)現(xiàn)alloxan處理組的O-GlcNAc糖基化水平降低,而OGA和OGT表達水平無明顯的變化。由alloxan對紫杉醇的細胞增殖抑制作用實驗結(jié)果表明alloxan所引起的O-GlcNAc糖基化水平的降低不影響紫杉醇對細胞的增值抑制作用。經(jīng)Western blotting方法檢測紫杉醇對OGA和OGT表達分布的影響,發(fā)現(xiàn)紫杉醇作用下細胞質(zhì)內(nèi)OGA和OGT的表達水平明顯增高。本課題還通過檢測紫杉醇處理p53野生型HCT116細胞和p53基因敲除的HCT116細胞,發(fā)現(xiàn)p53基因的缺失導致蛋白質(zhì)糖基化水平升高,并且發(fā)現(xiàn)p53參與紫杉醇誘導的蛋白質(zhì)O-GlcNAc糖基化改變。為進一步研究紫杉醇對蛋白質(zhì)O-GlcNAc糖基化水平影響機制奠定了基礎(chǔ)。在體內(nèi)荷瘤裸鼠實驗中,通過Western blotting方法檢測腫瘤組織及肝臟組織中蛋白質(zhì)O-GlcNAc糖基化及OGA和OGT的表達水平,結(jié)果發(fā)現(xiàn)在給藥劑量下紫杉醇沒有影響腫瘤組織和肝臟組織中O-GlcNAc糖基化、OGA和OGT的表達水平。為了深入研究紫杉醇對蛋白質(zhì)O-GlcNAc的影響機制,我們還進行了糖酵解途徑中的關(guān)鍵酶HK2和PKM2的糖基化位點鑒定等相關(guān)工作。本課題通過細胞轉(zhuǎn)染和免疫共沉淀的方法富集HK2和PKM2蛋白,之后通過膠內(nèi)酶解等方法進行預處理之后,經(jīng)質(zhì)譜方法分析鑒定了其O-GlcNAc糖基化位點。結(jié)果在蛋白質(zhì)HK2檢測到3個O-GlcNAc糖基化信號,而PKM2蛋白上檢測到16個O-GlcNAc糖基化信號。為之后進行O-GlcNAc糖基化修飾的功能研究奠定了基礎(chǔ)。本課題通過Lipofectamin2000將HK2和PKM2的真核表達載體轉(zhuǎn)染至乳腺癌細胞MDA-MB-231,然后經(jīng)過有限稀釋法加藥篩選出HK2和PKM2基因穩(wěn)定高表達的單克隆細胞株；首先運用shRNA干擾技術(shù)設(shè)計干擾HK2和PKM2基因的干擾片段,然后分別將含干擾HK2和PKM2基因的shRNA慢病毒顆粒感染乳腺癌MDA-MB-231細胞,通過加藥篩選出了HK2和PKM2基因沉默的細胞株。綜上所述,現(xiàn)已初步研究了體內(nèi)和體外試驗中紫杉醇在抗腫瘤活性中對蛋白質(zhì)O-GlcNAc糖基化修飾的影響及其機制。本論文發(fā)現(xiàn)紫杉醇可以誘導蛋白質(zhì)O-GlcNAc糖基化水平升高,并初步探討了其機制；蛋白質(zhì)O-GlcNAc糖基化水平的改變沒有影響紫杉醇的細胞增殖抑制活性；檢測出了PKM2和HK2的O-GlcNAc糖基化位點,而且還成功構(gòu)建了HK2和PKM2基因高表達和基因沉默的系列細胞株。這些工作為進一步研究O-GlcNAc糖基化修飾在抗腫瘤過程中的功能奠定了基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：O-GlcNAc糖基化 己糖激酶(HK2) 丙酮酸激酶M2型(PKM2) 紫杉醇 腫瘤
【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R96
【目錄】：

• 中文摘要10-13
• ABSTRACT13-16
• 符號說明16-18
• 第一章 前言18-28
• 1 蛋白質(zhì)的O-GlcNAc糖基化18-26
• 1.1 蛋白質(zhì)O-GlcNAc糖基化修飾過程的相關(guān)調(diào)節(jié)酶19-21
• 1.2 O-GlcNAc糖基化修飾的供體UDP-GlcNAc21-22
• 1.3 蛋白質(zhì)O-GlcNAc糖基化與糖酵解22-23
• 1.4 蛋白質(zhì)O-GlcNAc糖基化與抑癌基因p5323-24
• 1.5 蛋白質(zhì)O-GlcNAc糖基化位點的檢測24-25
• 1.6 蛋白質(zhì)的糖基化與藥物的抗腫瘤作用的相互影響25-26
• 2 紫杉醇的研究現(xiàn)狀26-27
• 3 本課題的研究意義27
• 4 本課題擬解決的問題27-28
• 第二章 紫杉醇抗腫瘤細胞增殖作用和蛋白質(zhì)O-GlcNAc糖基化水平的相互關(guān)系28-57
• 1 實驗材料28-30
• 1.1 細胞株28
• 1.2 主要試劑28-30
• 2 儀器設(shè)備30
• 3 實驗方法及步驟30-39
• 3.1 紫杉醇對乳腺癌細胞MDA-MB-231中蛋白質(zhì)O-GlcNAc糖基化的影響30-33
• 3.2 紫杉醇對乳腺癌細胞MDA-MB-231中OGA、OGT的mRNA水平的影響33-36
• 3.3 OGA的抑制劑對紫杉醇抗腫瘤作用的影響36-37
• 3.4 OGT的抑制劑對紫杉醇抗腫瘤作用的影響37-38
• 3.5 紫杉醇對OGT或OGA的細胞內(nèi)分布的影響38-39
• 3.6 p53基因?qū)Φ鞍踪|(zhì)O-GlcNAc糖基化的影響39
• 4 實驗結(jié)果39-54
• 4.1 紫杉醇對乳腺癌細胞MDA-MB-231中蛋白質(zhì)O-GlcNAc糖基化的影響39-44
• 4.2 紫杉醇對乳腺癌細胞OGA、OGT的mRNA水平的影響44-45
• 4.3 OGA抑制劑對紫杉醇抗細胞增殖作用的影響45-50
• 4.4 OGT抑制劑對紫杉醇抗細胞增殖作用的影響50-52
• 4.5 紫杉醇對OGT或OGA在細胞內(nèi)分布的影響52-53
• 4.6 p53基因?qū)Φ鞍踪|(zhì)O-GlcNAc糖基化的影響53-54
• 5 討論54-57
• 第三章 在荷瘤裸鼠中紫杉醇對蛋白質(zhì)O-GlcNAc糖基化水平的影響57-67
• 1 實驗材料57-58
• 1.1 細胞株57
• 1.2 實驗動物57
• 1.3 主要試劑57-58
• 1.4 病毒顆粒58
• 2 儀器設(shè)備58
• 3 實驗方法及步驟58-60
• 3.1 MDA-MB-231/GFP細胞株的構(gòu)建58-59
• 3.2 在裸鼠體內(nèi)紫杉醇對蛋白質(zhì)O-GlcNAc糖基化的影響59-60
• 4 實驗結(jié)果60-66
• 4.1 MDA-MB 231/GFP細胞株的構(gòu)建60-63
• 4.2 在裸鼠體內(nèi)紫杉醇對蛋白質(zhì)O-GlcNAc糖基化的影響63-66
• 5 討論66-67
• 第四章 丙酮酸激酶M2型(PKM2)及己糖激酶(HK2)的O-GlcNAc糖基化位點的鑒定及相關(guān)細胞株的構(gòu)建67-85
• 1 實驗材料67-68
• 1.1 細胞株及菌株67
• 1.2 生化試劑67-68
• 2 儀器設(shè)備68
• 3 實驗方法及步驟68-77
• 3.1 PKM2和HK2的O-GlcNAc糖基化位點的鑒定68-71
• 3.2 穩(wěn)定高表達PKM2的單克隆細胞株的構(gòu)建71-73
• 3.3 內(nèi)源性PKM2基因沉默細胞株的構(gòu)建73-74
• 3.4 穩(wěn)定高表達HK2的單克隆細胞株的構(gòu)建74-76
• 3.5 內(nèi)源性HK2基因沉默細胞株的構(gòu)建76-77
• 4 實驗結(jié)果77-83
• 4.1 PKM2和HK2的O-GlcNAc糖基化位點的鑒定77-79
• 4.2 穩(wěn)定高表達PKM2單克隆細胞株的構(gòu)建79-81
• 4.3 內(nèi)源性PKM2基因沉默細胞株的構(gòu)建81
• 4.4 穩(wěn)定高表達HK2單克隆細胞株的構(gòu)建81-82
• 4.5 內(nèi)源性HK2基因沉默細胞株的構(gòu)建82-83
• 5 討論83-85
• 全文結(jié)論85-86
• 參考文獻86-93
• 致謝93-94
• 攻讀碩士期間發(fā)表的論文94-95
• 附件95

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9 ;Chemoenzymatic synthesis of α2 3-sialylated carbohydrate epitopes[J];Science China(Chemistry);2011年01期

10 朱敏;沈愛國;丁炯;顧曉松;王鶴鳴;;Galβ-1,4-GlcNAc在鉗夾傷后大鼠坐骨神經(jīng)中的表達變化[J];中國臨床解剖學雜志;2006年06期

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1 ;A novel coupled-enzyme method for O-linked GIcNAc transferase activity assay[A];第六屆全國化學生物學學術(shù)會議論文摘要集[C];2009年

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6 Ju餼rez,S.;Hartweck,L.;Alamillo,J.M.;Simón-Mateo,C.;Pérez,J.J.;Fern餼ndez-Fern餼ndez,M.R.;Olszewski,N.E.;García,J.A.;;THE O-GlcNAc TRANSFERASE SECRET AGENT PLAYS A ROLE IN PLANT VIRUS INFECTION[A];中國植物病理學會2005年學術(shù)年會暨植物病理學報創(chuàng)刊50周年紀念會論文摘要集[C];2005年

7 Peng George Wang;;Design and synthesis of O-GIcNAcase inhibitor[A];2011年全國藥物化學學術(shù)會議——藥物的源頭創(chuàng)新論文摘要集[C];2011年

8 ;De-Novo Designed α-helix to Mimicking the OGT Binding with UDP-GlcNAc[A];第七屆全國磷化學化工暨第四屆海峽化學生物學、生物技術(shù)與醫(yī)藥發(fā)展討論會論文集[C];2006年

9 李艷梅;陳永湘;;利用ESI-MS和MALDI-TOF鑒定多肽O-GlcNAc修飾位點[A];中國蛋白質(zhì)組學第三屆學術(shù)大會論文摘要[C];2005年

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1 叢琦;蛋白質(zhì)O-GlcNAc修飾研究的方法探討[D];中國海洋大學;2012年

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5 張肖冰;蛋白質(zhì)O-GlcNAc糖基化在紫杉醇抗腫瘤活性中的作用研究[D];山東大學;2015年

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7 鄧瑞萍;基于人蛋白質(zhì)組芯片的新O-GlcNAc糖基轉(zhuǎn)移酶相互作用蛋白及底物發(fā)現(xiàn)研究[D];上海交通大學;2013年

8 樊瓊;O-GlcNAc修飾在結(jié)腸癌形成和遷移過程中的作用[D];中國海洋大學;2011年

9 顏金科;GlcNAc-BC共聚物的生物合成及其機理探究[D];海南大學;2012年

10 祝茜茜;氧連氮—乙酰葡糖胺（O-GlcNAc）修飾在肝癌肝移植后腫瘤復發(fā)轉(zhuǎn)移中的作用及其機制研究[D];浙江大學;2012年

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