本文關(guān)鍵詞：Temporin-1CEb改造肽對LPS誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)的影響及其作用機制的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：脂多糖(LPS)是革蘭氏陰性菌細胞壁的主要成分,又稱內(nèi)毒素,是誘發(fā)炎癥反應(yīng)的主要原因,過度的炎癥反應(yīng)會使生物體患膿毒癥等疾病,甚至?xí)䦟?dǎo)致生物體死亡�？咕氖巧矬w先天性免疫系統(tǒng)的重要組成成分,具有分子量小、理化性質(zhì)穩(wěn)定、對哺乳動物沒有毒性、廣譜的殺菌活性、自身不易引發(fā)耐藥性及抗炎等特性。本實驗室前期研究發(fā)現(xiàn):temporin-1CEb四種改造肽L-K6,L-K5,L-K6V1,L-K6V2具有很好的殺菌活性及溶血性低等特性。四種抗菌肽分別帶5-6個凈正電荷,可以與帶負電荷的LPS結(jié)合。所以本論文以人單核細胞U937為研究模型,探究四種抗菌肽對LPS介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)的影響及其作用機制。四種抗菌肽對U937細胞毒性實驗結(jié)果表明,L-K6,L-K5,L-K6V1,L-K6V2對U937細胞的毒性很小。當抗菌肽在低濃度時,基本對細胞無毒性;當抗菌肽在高濃度時,L-K5,L-K6V1,L-K6V2對細胞的毒性不大,細胞的存活率仍然達到85%左右,殺傷力最強的L-K6處理的細胞存活率也能達到70%。說明這四種抗菌肽都能作為抗炎的實驗材料。LPS侵入生物體內(nèi)后,可以激活免疫細胞,誘使其釋放炎癥因子,如TNF-α、IL-8、NO等,進而引發(fā)炎癥。我們的實驗結(jié)果顯示抗菌肽L-K6,L-K5,L-K6V1,L-K6V2能夠明顯抑制LPS誘導(dǎo)的炎癥因子TNF-α、IL-8、NO的釋放。即使在低濃度20μM時,四種抗菌肽也能很好的抑制TNF-α、IL-8、NO的釋放,其中,L-K6的抑制能力最強。綜上可見,四種抗菌肽都有抑制LPS誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)的能力。圓二色譜(CD)和等溫滴定量熱儀(ITC)測定四種抗菌肽與LPS的結(jié)合能力。CD實驗結(jié)果顯示四種抗菌肽在SP緩沖溶液中均呈無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu),但在LPS溶液中,四種抗菌肽的二級結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)規(guī)則的α-螺旋結(jié)構(gòu),說明LPS可以誘導(dǎo)抗菌肽形成規(guī)則結(jié)構(gòu);ITC實驗表明抗菌肽的正電荷可以通過靜電作用與LPS的負電荷結(jié)合,其中L-K6和L-K6V1與LPS的結(jié)合能力強于L-K5和L-K6V2與LPS的結(jié)合能力。四種抗菌肽都能使LPS聚集體解聚,L-K6處理后,直徑在6000nm大小的LPS全部消失,L-K5解聚程度相對較弱。四種抗菌肽都能很好的抑制LPS與細胞結(jié)合,其中L-K6的抑制能力最強,L-K5的抑制能力相對較弱。細胞流式實驗也證明四種抗菌肽通過與CD14的相互作用,直接抑制了LPS與細胞炎癥信號傳導(dǎo)通路受體CD14的結(jié)合,L-K6和L-K6V1的抑制效果強于L-K6V2和L-K5。RT-qPCR檢測抗菌肽對MyD88、IκK、NFκB表達的影響。實驗結(jié)果表明:抗菌肽能夠不同程度的抑制MyD88、IκK、NFκB的表達,其中L-K6的抑制能力最強。
【關(guān)鍵詞】：抗菌肽 脂多糖(LPS) 炎癥
【學(xué)位授予單位】：遼寧師范大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R915
【目錄】：

• 摘要4-6
• Abstract6-10
• 引言10-11
• 1 文獻綜述11-20
• 1.1 炎癥與膿毒癥的研究進展11-12
• 1.2 LPS誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)的研究進展12-16
• 1.2.1 LPS的來源及其結(jié)構(gòu)特點12-13
• 1.2.2 LPS的功能特點13
• 1.2.3 LPS引起炎癥反應(yīng)的作用機制13-15
• 1.2.4 與LPS引起的炎癥反應(yīng)有關(guān)的通路蛋白及炎癥因子15-16
• 1.3 抗菌肽的來源及其結(jié)構(gòu)特點16-17
• 1.4 抗菌肽的作用特點17
• 1.5 抗菌肽在先天性免疫中的作用17-20
• 1.5.1 適當性的表達可增強宿主抗感染的能力18
• 1.5.2 充當免疫細胞的趨化因子18
• 1.5.3 抗菌肽對炎癥關(guān)鍵性啟動因子LPS的調(diào)節(jié)作用18-20
• 2. 抗菌肽對U937細胞毒性及其對LPS誘導(dǎo)炎癥的影響20-28
• 2.1 實驗材料20
• 2.1.1 實驗材料及試劑20
• 2.1.2 實驗儀器20
• 2.2 實驗方法20-22
• 2.2.1 細胞培養(yǎng)20
• 2.2.2 MTT檢測抗菌肽對U937細胞毒性試驗20-21
• 2.2.3 TNF-α 含量的測定21
• 2.2.4 IL-8 含量的測定21-22
• 2.2.5 NO含量的測定22
• 2.2.6 統(tǒng)計分析22
• 2.3 結(jié)果22-26
• 2.3.1 抗菌肽對U937細胞毒性作用22-23
• 2.3.2 抗菌肽對LPS誘導(dǎo)的U937細胞TNF-α 的影響23-24
• 2.3.3 抗菌肽對LPS誘導(dǎo)U937細胞IL-8 的影響24-25
• 2.3.4 抗菌肽對LPS誘導(dǎo)U937細胞NO的影響25-26
• 2.4 討論26-28
• 3 抗菌肽抑制LPS誘導(dǎo)炎癥的機制28-42
• 3.1 實驗材料28-29
• 3.1.1 材料及試劑28
• 3.1.2 實驗儀器28-29
• 3.2 實驗方法29-31
• 3.2.1 圓二色譜法測定抗菌肽的二級結(jié)構(gòu)29
• 3.2.2 ITC檢測抗菌肽與LPS結(jié)合29
• 3.2.3 抗菌肽解離LPS聚體29
• 3.2.4 動態(tài)光散射（DLS）29-30
• 3.2.5 抗菌肽抑制LPS與U937細胞結(jié)合30
• 3.2.6 細胞流式檢測抗菌肽對LPS與U937細胞結(jié)合的影響30
• 3.2.7 細胞膜CD14測定30
• 3.2.8 細胞總RNA的提取30-31
• 3.2.9 實時熒光定量PCR31
• 3.3 實驗結(jié)果31-40
• 3.3.1 抗菌肽的二級結(jié)構(gòu)31-32
• 3.3.2 抗菌肽結(jié)合LPS32-34
• 3.3.3 抗菌肽解聚LPS聚體34-36
• 3.3.4 抗菌肽抑制LPS與細胞結(jié)合能力檢測36-37
• 3.3.5 抗菌肽與CD14結(jié)合能力的測定37-38
• 3.3.6 抗菌肽對MyD88/IκB/NFκB通路蛋白表達的影響38-40
• 3.4 討論40-42
• 結(jié)論42-43
• 參考文獻43-47
• 附錄A β-acton、MyD88、IκB-α、NFκB的溶解曲線和擴增曲線47-51
• 攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表學(xué)術(shù)論文情況51-52
• 致謝52

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本文編號：324796