本文關(guān)鍵詞：Temporin-1CEb改造肽對(duì)LPS誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)的影響及其作用機(jī)制的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：脂多糖(LPS)是革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁的主要成分,又稱(chēng)內(nèi)毒素,是誘發(fā)炎癥反應(yīng)的主要原因,過(guò)度的炎癥反應(yīng)會(huì)使生物體患膿毒癥等疾病,甚至?xí)䦟?dǎo)致生物體死亡�？咕氖巧矬w先天性免疫系統(tǒng)的重要組成成分,具有分子量小、理化性質(zhì)穩(wěn)定、對(duì)哺乳動(dòng)物沒(méi)有毒性、廣譜的殺菌活性、自身不易引發(fā)耐藥性及抗炎等特性。本實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn):temporin-1CEb四種改造肽L-K6,L-K5,L-K6V1,L-K6V2具有很好的殺菌活性及溶血性低等特性。四種抗菌肽分別帶5-6個(gè)凈正電荷,可以與帶負(fù)電荷的LPS結(jié)合。所以本論文以人單核細(xì)胞U937為研究模型,探究四種抗菌肽對(duì)LPS介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)的影響及其作用機(jī)制。四種抗菌肽對(duì)U937細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,L-K6,L-K5,L-K6V1,L-K6V2對(duì)U937細(xì)胞的毒性很小。當(dāng)抗菌肽在低濃度時(shí),基本對(duì)細(xì)胞無(wú)毒性;當(dāng)抗菌肽在高濃度時(shí),L-K5,L-K6V1,L-K6V2對(duì)細(xì)胞的毒性不大,細(xì)胞的存活率仍然達(dá)到85%左右,殺傷力最強(qiáng)的L-K6處理的細(xì)胞存活率也能達(dá)到70%。說(shuō)明這四種抗菌肽都能作為抗炎的實(shí)驗(yàn)材料。LPS侵入生物體內(nèi)后,可以激活免疫細(xì)胞,誘使其釋放炎癥因子,如TNF-α、IL-8、NO等,進(jìn)而引發(fā)炎癥。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示抗菌肽L-K6,L-K5,L-K6V1,L-K6V2能夠明顯抑制LPS誘導(dǎo)的炎癥因子TNF-α、IL-8、NO的釋放。即使在低濃度20μM時(shí),四種抗菌肽也能很好的抑制TNF-α、IL-8、NO的釋放,其中,L-K6的抑制能力最強(qiáng)。綜上可見(jiàn),四種抗菌肽都有抑制LPS誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)的能力。圓二色譜(CD)和等溫滴定量熱儀(ITC)測(cè)定四種抗菌肽與LPS的結(jié)合能力。CD實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示四種抗菌肽在SP緩沖溶液中均呈無(wú)規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu),但在LPS溶液中,四種抗菌肽的二級(jí)結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)規(guī)則的α-螺旋結(jié)構(gòu),說(shuō)明LPS可以誘導(dǎo)抗菌肽形成規(guī)則結(jié)構(gòu);ITC實(shí)驗(yàn)表明抗菌肽的正電荷可以通過(guò)靜電作用與LPS的負(fù)電荷結(jié)合,其中L-K6和L-K6V1與LPS的結(jié)合能力強(qiáng)于L-K5和L-K6V2與LPS的結(jié)合能力。四種抗菌肽都能使LPS聚集體解聚,L-K6處理后,直徑在6000nm大小的LPS全部消失,L-K5解聚程度相對(duì)較弱。四種抗菌肽都能很好的抑制LPS與細(xì)胞結(jié)合,其中L-K6的抑制能力最強(qiáng),L-K5的抑制能力相對(duì)較弱。細(xì)胞流式實(shí)驗(yàn)也證明四種抗菌肽通過(guò)與CD14的相互作用,直接抑制了LPS與細(xì)胞炎癥信號(hào)傳導(dǎo)通路受體CD14的結(jié)合,L-K6和L-K6V1的抑制效果強(qiáng)于L-K6V2和L-K5。RT-qPCR檢測(cè)抗菌肽對(duì)MyD88、IκK、NFκB表達(dá)的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:抗菌肽能夠不同程度的抑制MyD88、IκK、NFκB的表達(dá),其中L-K6的抑制能力最強(qiáng)。
【關(guān)鍵詞】：抗菌肽 脂多糖(LPS) 炎癥
【學(xué)位授予單位】：遼寧師范大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類(lèi)號(hào)】：R915
【目錄】：

• 摘要4-6
• Abstract6-10
• 引言10-11
• 1 文獻(xiàn)綜述11-20
• 1.1 炎癥與膿毒癥的研究進(jìn)展11-12
• 1.2 LPS誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)的研究進(jìn)展12-16
• 1.2.1 LPS的來(lái)源及其結(jié)構(gòu)特點(diǎn)12-13
• 1.2.2 LPS的功能特點(diǎn)13
• 1.2.3 LPS引起炎癥反應(yīng)的作用機(jī)制13-15
• 1.2.4 與LPS引起的炎癥反應(yīng)有關(guān)的通路蛋白及炎癥因子15-16
• 1.3 抗菌肽的來(lái)源及其結(jié)構(gòu)特點(diǎn)16-17
• 1.4 抗菌肽的作用特點(diǎn)17
• 1.5 抗菌肽在先天性免疫中的作用17-20
• 1.5.1 適當(dāng)性的表達(dá)可增強(qiáng)宿主抗感染的能力18
• 1.5.2 充當(dāng)免疫細(xì)胞的趨化因子18
• 1.5.3 抗菌肽對(duì)炎癥關(guān)鍵性啟動(dòng)因子LPS的調(diào)節(jié)作用18-20
• 2. 抗菌肽對(duì)U937細(xì)胞毒性及其對(duì)LPS誘導(dǎo)炎癥的影響20-28
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料20
• 2.1.1 實(shí)驗(yàn)材料及試劑20
• 2.1.2 實(shí)驗(yàn)儀器20
• 2.2 實(shí)驗(yàn)方法20-22
• 2.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)20
• 2.2.2 MTT檢測(cè)抗菌肽對(duì)U937細(xì)胞毒性試驗(yàn)20-21
• 2.2.3 TNF-α 含量的測(cè)定21
• 2.2.4 IL-8 含量的測(cè)定21-22
• 2.2.5 NO含量的測(cè)定22
• 2.2.6 統(tǒng)計(jì)分析22
• 2.3 結(jié)果22-26
• 2.3.1 抗菌肽對(duì)U937細(xì)胞毒性作用22-23
• 2.3.2 抗菌肽對(duì)LPS誘導(dǎo)的U937細(xì)胞TNF-α 的影響23-24
• 2.3.3 抗菌肽對(duì)LPS誘導(dǎo)U937細(xì)胞IL-8 的影響24-25
• 2.3.4 抗菌肽對(duì)LPS誘導(dǎo)U937細(xì)胞NO的影響25-26
• 2.4 討論26-28
• 3 抗菌肽抑制LPS誘導(dǎo)炎癥的機(jī)制28-42
• 3.1 實(shí)驗(yàn)材料28-29
• 3.1.1 材料及試劑28
• 3.1.2 實(shí)驗(yàn)儀器28-29
• 3.2 實(shí)驗(yàn)方法29-31
• 3.2.1 圓二色譜法測(cè)定抗菌肽的二級(jí)結(jié)構(gòu)29
• 3.2.2 ITC檢測(cè)抗菌肽與LPS結(jié)合29
• 3.2.3 抗菌肽解離LPS聚體29
• 3.2.4 動(dòng)態(tài)光散射（DLS）29-30
• 3.2.5 抗菌肽抑制LPS與U937細(xì)胞結(jié)合30
• 3.2.6 細(xì)胞流式檢測(cè)抗菌肽對(duì)LPS與U937細(xì)胞結(jié)合的影響30
• 3.2.7 細(xì)胞膜CD14測(cè)定30
• 3.2.8 細(xì)胞總RNA的提取30-31
• 3.2.9 實(shí)時(shí)熒光定量PCR31
• 3.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果31-40
• 3.3.1 抗菌肽的二級(jí)結(jié)構(gòu)31-32
• 3.3.2 抗菌肽結(jié)合LPS32-34
• 3.3.3 抗菌肽解聚LPS聚體34-36
• 3.3.4 抗菌肽抑制LPS與細(xì)胞結(jié)合能力檢測(cè)36-37
• 3.3.5 抗菌肽與CD14結(jié)合能力的測(cè)定37-38
• 3.3.6 抗菌肽對(duì)MyD88/IκB/NFκB通路蛋白表達(dá)的影響38-40
• 3.4 討論40-42
• 結(jié)論42-43
• 參考文獻(xiàn)43-47
• 附錄A β-acton、MyD88、IκB-α、NFκB的溶解曲線和擴(kuò)增曲線47-51
• 攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表學(xué)術(shù)論文情況51-52
• 致謝52

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本文編號(hào)：324796