本文關鍵詞：基于質譜的糖蛋白糖鏈結構解析策略研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：蛋白質糖基化修飾在生理病理過程中起著重要作用,但糖蛋白質糖鏈結構分析方法仍在發(fā)展中,糖蛋白質組學的方法研究成為研究重點。在病理發(fā)生發(fā)展過程中,位點特異性糖鏈結構的變化顯著。而傳統(tǒng)的PNGase F切糖與相應的修飾位點與糖鏈結構鑒定技術,無法將糖肽的糖基化位點,與相應的糖鏈聯(lián)系在一起,所以,位點特異性糖鏈結構解析成為當前糖蛋白質組研究的重要目標。本論文有三章構成,第一章,首先介紹糖蛋白質組學的研究現(xiàn)狀,糖基化位點及糖鏈結構解析的重要性;其次對糖基化位點、糖鏈結構獲取方法及完整糖肽結構解析的常用策略進行概述。第二章,介紹了基于固定化Pronase E酶切,解析位點特異糖鏈結構方法的建立。文中對Pronase E溶液酶切的蛋白與酶的用量比,酶切時間,Pronase E固定化酶的材料選擇,及固定化酶的有效貯存時間進行監(jiān)測,并比較優(yōu)化了親水相互作用色譜和多孔石墨化炭黑兩種富集方法、α-氰基-4-羥基肉桂酸和2,5-二羥基苯甲酸兩種基質,對于糖鏈結構鑒定的選擇性。另外,對比了MALDI-TOF儀器和高精度Q-Exactive儀器,對于檢測糖鏈結構或完整糖蛋白方面的差異性。最后選擇Pronase E溶液酶切,蛋白比酶1:1以上,酶切時間為48 h;Pronase E固定化酶的材料選用CNBr Beads,酶與材料質量比1:10的比例,進行固定化酶的合成,結合效率為40%,酶切時間為24 h。選擇多孔石墨化炭黑富集,Pronase E所得糖鏈使用DHB為基質,PNGase F所得糖鏈選用DHB+1 mM Na Cl為基質進行MALDI-TOF檢測。第三章,建立完整糖肽的分析策略,實現(xiàn)對血清高豐度糖蛋白的完整糖肽的定性定量分析。以IgG為標準糖蛋白,經過Trypsin酶切及HILIC富集,獲得完整糖肽,在此基礎上,經過PNGase F酶切,獲得糖基化位點信息,結合完整糖肽的檢測信息,借助Byonic(Proteomics Discover 2.0)和Maxquant兩個軟件,并將兩個軟件得到的數據整合,獲取完整糖肽的糖基化位點及糖型信息,通過位點特異性糖肽的峰面積,以實現(xiàn)完整糖肽定量分析。并將此方法應用于人血清11種高豐度糖蛋白的完整糖肽的分析,實現(xiàn)對肺癌血清樣本的完整糖肽的定性定量鑒定。為獲取肺癌的高豐度蛋白質糖肽組成特征,尋求可能的診斷標志物提供了方法策略。
【關鍵詞】：糖蛋白 糖鏈結構 固定化 Pronase E 人血清高豐度糖蛋白 完整糖肽 定性定量分析
【學位授予單位】：安徽醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R917
【目錄】：

• 摘要5-7
• Abstract7-9
• 第一章 前言9-13
• 1.1 糖蛋白質結構與重要功能9
• 1.2 糖蛋白的分離與富集研究方法9-11
• 1.2.1 糖蛋白的富集策略9-10
• 1.2.2 糖鏈結構的研究方法10
• 1.2.3 完整糖肽的分析方法10-11
• 1.3 本論文研究內容11-13
• 第二章 基于固定化PRONASE E酶與質譜的糖鏈結構分析方法13-31
• 2.1 前言13-14
• 2.2 實驗部分14-19
• 2.2.1 儀器與試劑14-15
• 2.2.2 實驗方法15-19
• 2.3 結果與討論19-30
• 2.3.1 酶切方案優(yōu)化19-20
• 2.3.2 聚糖MALDI-TOF-MS分析的基質選擇20
• 2.3.3 糖鏈富集純化方法選擇20-22
• 2.3.4 Pronase E酶解條件優(yōu)化22-24
• 2.3.5 高精度質譜Q-Exactive檢測結果24-28
• 2.3.6 固定化Pronase E酶的活性監(jiān)測28-30
• 2.4 結論30-31
• 第三章 血清高豐度糖蛋白的完整糖肽分析31-44
• 3.1 前言31-32
• 3.2 實驗部分32-36
• 3.2.1 儀器與試劑32
• 3.2.2 實驗方法32-36
• 3.3 結果和討論36-43
• 3.3.1 IgG糖蛋白36-37
• 3.3.2 血清高豐度糖蛋白37-43
• 3.4 結論43-44
• 參考文獻44-51
• 個人簡歷51
• 在學期間發(fā)表的論文51-53
• 致謝53-55
• 綜述55-68
• 參考文獻63-68
• 附錄68-91

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本文編號：310197