本文關(guān)鍵詞：人源及雜合抗菌肽在乳酸乳球菌中重組分泌表達(dá)，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：研究背景目前,隨著抗生素的廣泛應(yīng)用,細(xì)菌的抗生素耐藥率及耐藥譜正得到快速增加和擴(kuò)展,現(xiàn)有的基于微生物種間作用產(chǎn)生的抗生素類抗菌藥物將面臨前所未有的危機(jī)。另外腸道菌群平衡與人體健康有著密切關(guān)系,當(dāng)菌群失調(diào)時(shí)會(huì)導(dǎo)致宿主多種疾病的發(fā)生,尤其是腸道疾病,如腹瀉、IBD等�？咕�(Antibacterial peptides)又叫抗微生物肽(Antimicrobial peptides, AMPs),是由多種生物細(xì)胞特定基因編碼經(jīng)外界條件誘導(dǎo)產(chǎn)生的一類具有廣譜抗細(xì)菌、真菌、病毒、原蟲、抑殺腫瘤細(xì)胞等活性作用的多肽,但對(duì)于人體有益菌則無明顯抑菌效果。它作為天然免疫系統(tǒng)的重要組成成分,同時(shí)因其廣譜抑菌活性和不易產(chǎn)生耐藥性的特性,可能成為一種新的控制感染和調(diào)節(jié)腸道菌群的有效途徑[3]。如今已確認(rèn)被收錄入數(shù)據(jù)庫(kù)的抗菌肽數(shù)目就達(dá)到1500多種,種類來源包括細(xì)菌、植物、昆蟲、兩棲動(dòng)物、無脊椎動(dòng)物、哺乳動(dòng)物等。對(duì)于人類本身也有自身分泌的抗菌肽,目前人源類抗菌肽研究較多、作用效果廣泛的有兩大家族,分別是cathelicidins家族和defensins家族。LL-37是迄今為止在人體中發(fā)現(xiàn)的唯一一種Cathelicidins家族抗菌肽,廣泛存在于胃腸道和泌尿道、呼吸道等組織上皮細(xì)胞分泌的中性粒細(xì)胞中,在組織受到炎癥、感染和損傷時(shí)LL-37分泌明顯增加。LL-37具有廣譜抗菌活性,對(duì)多種革蘭陽性菌、陰性菌以及真菌均有效,同時(shí)LL-37作為免疫調(diào)節(jié)因子可通過角質(zhì)細(xì)胞釋放IL-8來影響宿主炎癥應(yīng)答。人a防御素5(alpha human defensin-5,簡(jiǎn)稱HD5)是防御素家族中一個(gè)重要的抗菌肽,它主要在小腸潘氏細(xì)胞中大量分泌表達(dá),可隨著腸道中受到炎癥、感染和細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化等因素的刺激而上調(diào)分泌表達(dá)。HD5不僅具有高效的廣譜抑殺病原菌活性和能在免疫調(diào)節(jié)起到保護(hù)作用,還可以抗HIV、HSV等病毒作用。鑒于抗菌肽的多種活性功能,在研發(fā)新型抗菌藥物及協(xié)同調(diào)節(jié)免疫方面得到了更多的關(guān)注�，F(xiàn)今,抗菌肽主要從天然資源中提取,但成本高、得率低、工序繁瑣等制約著其廣泛應(yīng)用；而化學(xué)合成法則價(jià)格相對(duì)昂貴,也難以應(yīng)用于臨床。利用基因工程技術(shù)生產(chǎn)抗菌肽則具有重要意義。乳酸菌作為與人類生活緊密相關(guān)的益生菌,被公認(rèn)為安全的食品級(jí)微生物(generally regarded as safe, GRAS)。它不僅能抑制有害菌生長(zhǎng),也能促進(jìn)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的合成,改善胃腸道功能,治療胃腸道疾病。本實(shí)驗(yàn)選用乳酸乳球菌中nisin(乳鏈菌肽)調(diào)控表達(dá)系統(tǒng)(nisin-controlled gene expression,NICE),它是乳酸菌中應(yīng)用最廣泛、可控性最強(qiáng)的表達(dá)系統(tǒng)。通過乳酸菌表達(dá)系統(tǒng)和SOE(gene splicing by overlap extension)人工合成目的抗菌肽基因獲得人源和雜合抗菌肽的蛋白分泌表達(dá),研究其體外抗菌活性,同時(shí)體現(xiàn)益生菌和抗菌肽的協(xié)同作用,為后續(xù)動(dòng)物及臨床實(shí)驗(yàn)提供基礎(chǔ)。目的1、根據(jù)天然人源抗菌肽LL-37和HD5的基因序列設(shè)計(jì)活性更好的雜合抗菌肽LLD1和LLD2。2、體外拼裝合成四條抗菌肽LL-37、HD5、LLD1和LLD2,并構(gòu)建重組分泌型表達(dá)載體pNZ8148-sp-LL37/HD5/LLD1/LLD2,最終在乳酸乳球菌NZ9000中分泌表達(dá)。方法1、選取抗菌肽LL-37與抗菌肽HD5作為雜合設(shè)計(jì)的藍(lán)本,在GenBank中找到此兩條抗菌肽的基因序列,根據(jù)乳酸乳球菌的偏愛密碼子從新優(yōu)化它們的基因序列,以使其能在乳酸乳球菌中更好的表達(dá)。最終設(shè)計(jì)了兩條雜合抗菌肽LLD1和LLD2的基因序列,并通過生物信息學(xué)方法對(duì)此總共四條抗菌肽的二級(jí)結(jié)構(gòu)、兩親性、等電點(diǎn)、跨膜區(qū)域等方面進(jìn)行分析預(yù)測(cè),從中比較它們之間的抗菌活性。2、根據(jù)乳酸乳球菌表達(dá)偏愛密碼子的數(shù)據(jù)庫(kù),得到優(yōu)化后的四條抗菌肽基因序列。分別將每條抗菌肽的基因全序列分為4段,設(shè)計(jì)成具有18-20bp的重疊引物,利用重疊延伸PCR方法擴(kuò)增合成抗菌肽基因全序列,并在基因序列兩端引入限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)Kpn I和Xba I。最后將合成的四條抗菌肽基因分別與質(zhì)粒pMD19-T simple連接構(gòu)建重組質(zhì)粒,用化學(xué)轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化到大腸桿菌Top10中。得到陽性克隆子后,提取質(zhì)粒,用雙酶切鑒定法和基因測(cè)序進(jìn)行驗(yàn)證。3、將驗(yàn)證正確的四種抗菌肽重組子進(jìn)行雙酶切,切膠回收抗菌肽基因序列片段,與分泌型表達(dá)載體pNZ8148-sp質(zhì)粒連接,電轉(zhuǎn)化到乳酸乳球菌NZ9000中,構(gòu)建四種重組乳酸菌。通過菌液PCR法、雙酶切法和基因測(cè)序鑒定陽性轉(zhuǎn)化子。挑取驗(yàn)證正確的重組乳酸菌進(jìn)行培養(yǎng),經(jīng)過nisin誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)后,四種抗菌肽分別得到分泌表達(dá),通過Tricine-SDS-PAGE凝膠電泳、Western Blot和Dot Blot鑒定表達(dá)產(chǎn)物。利用截留分子量為30KD和1KD的超濾離心管分步進(jìn)行超濾離心濃縮上清表達(dá)產(chǎn)物,得到較為純化的上清液進(jìn)行抑菌活性實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果1、我們通過乳酸乳球菌的偏愛密碼子,重新設(shè)計(jì)抗菌肽LL-37和HD5的基因序列,并以此為母本,雜合設(shè)計(jì)出兩條新的抗菌肽LLD1和LLD2。經(jīng)過生物信息學(xué)分析,抗菌肽LLD1、LLD2、HD5、LL-37都屬于α-螺旋結(jié)構(gòu)為主的陽離子型抗菌肽,它們的C-端都具有兩親性。兩親性表現(xiàn)明顯的抗菌肽LLD2,它的C端疏水性最強(qiáng)。四條抗菌肽均沒有沒有明顯的跨膜螺旋區(qū)域,意味著它們也許并不是傳統(tǒng)意義的跨膜蛋白,其作用機(jī)制可能與通過靜電引力與細(xì)胞膜相結(jié)合,進(jìn)而形成穿膜孔洞相關(guān)。經(jīng)過一系列分析后,整體來講,經(jīng)過雜合的抗菌肽LLD2可能比其它三條抗菌肽的抗菌活性更強(qiáng)。2、利用設(shè)計(jì)合成好的互補(bǔ)引物,通過重疊延伸PCR成功合成目的抗菌肽基因的全長(zhǎng)序列。本實(shí)驗(yàn)合成抗菌肽LLD1基因全長(zhǎng)為100bp,LLD2基因全長(zhǎng)為112bp,HD5基因全長(zhǎng)為115bp,LL37基因全長(zhǎng)為130bp,經(jīng)電泳結(jié)果分析,與預(yù)期擴(kuò)增片段大小一致。經(jīng)過雙酶切鑒定和基因測(cè)序均顯示驗(yàn)證正確。表明已成功克隆LLD1、LLD2、HD5和LL37四條目的片段,將該重組質(zhì)粒分別命名為pMD19Ts-LLD1、pMD19Ts-LLD2、pMD19Ts-HD5 和 pMD19Ts-LL37。3、經(jīng)過菌液PCR驗(yàn)證,四條目的載體pNZ8148-sp-LLD1/LLD2/HD5/LL37的預(yù)計(jì)合成片段大小分別為400bp,412bp,415bp和430bp。在相對(duì)應(yīng)的泳道位置上均可見單一的明亮條帶,并大小一致,說明重組乳酸菌轉(zhuǎn)化成功。根據(jù)雙酶切和基因測(cè)序鑒定結(jié)果,表明重組分泌表達(dá)抗菌肽的乳酸乳球菌構(gòu)建成功。最終得到4種重組乳酸乳球菌,分別命名為NZ9000-SLLD1, NZ9000-SLLD2, NZ9000-SHD5和NZ9000-SLL37.對(duì)四種重組乳酸菌的發(fā)酵上清液分別進(jìn)行Tricine-SDS-PAGE凝膠電泳檢測(cè),在3.5-5KDa位置之間均可看到明亮的條帶,與預(yù)計(jì)的抗菌肽蛋白大小一致。并經(jīng)過免疫檢測(cè),確認(rèn)四種抗菌肽蛋白均得到正確分泌表達(dá)。上清表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)過純化濃縮后進(jìn)行抑菌實(shí)驗(yàn)檢測(cè),可看到四種抗菌肽均有表現(xiàn)出抑菌效果。并應(yīng)用不同體積的發(fā)酵上清進(jìn)行獨(dú)立的抑菌試驗(yàn),發(fā)現(xiàn)當(dāng)上清達(dá)到10mL時(shí),大腸桿菌會(huì)被基本抑制生長(zhǎng)。但在牛津杯抑菌實(shí)驗(yàn)過程中,抑菌的重現(xiàn)性欠佳,由于選用的人源抗菌肽本身對(duì)益生菌無明顯抑菌作用,因此主要考慮為誘導(dǎo)過程中抗菌肽受到宿主細(xì)胞中蛋白酶的影響及純化條件不足導(dǎo)致蛋白純度和濃度不夠�？蛇M(jìn)一步完善樣品純化工藝,確保檢測(cè)樣品的穩(wěn)定性。結(jié)論1、為得到抗菌活性更強(qiáng)的抗菌肽以及能更易獲取抗菌肽和讓其更好的針對(duì)人體腸道疾病的治療,本實(shí)驗(yàn)針對(duì)如何提高抗菌肽活性進(jìn)行了雜合設(shè)計(jì)和一系列的生物信息學(xué)研究,并且利用分子克隆技術(shù)構(gòu)建重組益生菌另其得以源源不斷表達(dá)目的抗菌肽。2、本實(shí)驗(yàn)以抗菌肽HD5和LL37為藍(lán)本進(jìn)行雜合,設(shè)計(jì)了雜合抗菌肽LLD1和LLD2。利用生物信息學(xué)軟件對(duì)四條抗菌肽序列進(jìn)行等電點(diǎn)、兩親性、二級(jí)結(jié)構(gòu)以及跨膜結(jié)構(gòu)等預(yù)測(cè)分析,可以發(fā)現(xiàn),抗菌肽LLD1、LLD2、HD5和LL37的等電點(diǎn)都大于7,它們的結(jié)構(gòu)都是以α-螺旋結(jié)構(gòu)為主。而且,經(jīng)過雜合后的兩條抗菌肽,尤其是抗菌肽LLD2,具有較母肽HD5和LL37更好的抑菌活性。3、本實(shí)驗(yàn)利用重疊延生PCR法合成四條抗菌肽基因LLD1、LLD2、HD5和LL37,并在pMD19-T simple載體中成功克隆,得到正確的抗菌肽基因序列。4、 本實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建重組分泌型表達(dá)載體pNZ8148-sp-LLD 1/LLD2/HD5/LL37,最終轉(zhuǎn)化到益生菌乳酸乳球菌NZ9000中,成功構(gòu)建了4種轉(zhuǎn)化基因工程菌NZ9000-SLLD1,NZ9000-SLLD2,NZ9000-SHD5和NZ9000-SLL37,并成功進(jìn)行了誘導(dǎo)表達(dá)。將含抗菌肽的發(fā)酵上清進(jìn)行抑菌實(shí)驗(yàn),可見四種抗菌肽均有表現(xiàn)出抑菌效果。但由于樣品純化工藝存在不足,抗菌肽的純度和濃度欠佳,抑菌效果并不是十分穩(wěn)定。5、在現(xiàn)有研究的基礎(chǔ)上,在以下方面還有待進(jìn)一步研究和提高：(1)提高抗菌肽的表達(dá)量和穩(wěn)定性。(2)進(jìn)一步進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn),驗(yàn)證其在腸道菌群中的調(diào)節(jié)作用和對(duì)腸道免疫屏障的防御作用。(3)進(jìn)一步改善抗菌肽基因的設(shè)計(jì),研制更高效能的抗菌肽。
【關(guān)鍵詞】：人源抗菌肽 雜合抗菌肽 乳酸乳球菌 分泌表達(dá)
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R915;Q78
【目錄】：

• 摘要3-8
• ABSTRACT8-19
• 第一章 緒論19-31
• 1.1 抗菌肽的生物學(xué)特征19-20
• 1.1.1 抗菌肽來源19
• 1.1.2 抗菌肽的理化性質(zhì)和決定因素19-20
• 1.1.3 抗菌肽的結(jié)構(gòu)多樣性20
• 1.2 抗菌肽的作用機(jī)制20-25
• 1.2.1 抗菌活性21-23
• 1.2.2 抗病毒活性23-24
• 1.2.3 抗真菌活性24
• 1.2.4 抗寄生蟲活性24-25
• 1.2.5 免疫調(diào)節(jié)及進(jìn)一步活動(dòng)25
• 1.3 抗菌肽的臨床應(yīng)用及前景25-28
• 1.3.1 作為抗菌消炎藥的臨床應(yīng)用26-27
• 1.3.2 抗腫瘤藥物27-28
• 1.3.3 免疫調(diào)節(jié)28
• 1.4 藥物載體28-29
• 1.5 面臨的問題29-30
• 1.5.1 抗菌肽產(chǎn)品的來源問題29
• 1.5.2 抗菌肽的活性問題29-30
• 1.5.3 抗菌肽的毒性問題30
• 1.5.4 抗菌肽的體內(nèi)穩(wěn)定性問題30
• 1.5.5 抗菌肽的耐藥性問題30
• 1.6 展望30-31
• 第二章 雜合抗菌肽的分子設(shè)計(jì)及結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)31-41
• 2.1 實(shí)驗(yàn)方法31-33
• 2.1.1 抗菌肽母本選擇31-32
• 2.1.2 雜合原理32
• 2.1.3 生物信息學(xué)分析32-33
• 2.2 結(jié)果與分析33-39
• 2.2.1 抗菌肽序列33
• 2.2.2 抗菌肽的理化性質(zhì)分析33-34
• 2.2.3 二級(jí)結(jié)構(gòu)分析34-36
• 2.2.4 跨膜預(yù)測(cè)36-37
• 2.2.5 抗菌肽兩親性分析37-39
• 2.3 結(jié)論與討論39-41
• 第三章 人源及雜合抗菌肽基因的合成41-54
• 3.1 實(shí)驗(yàn)材料41-42
• 3.1.1 實(shí)驗(yàn)菌種與質(zhì)粒41
• 3.1.2 實(shí)驗(yàn)主要儀器41
• 3.1.3 實(shí)驗(yàn)主要試劑及試劑盒41-42
• 3.1.4 培養(yǎng)基及其配制42
• 3.1.5 其它試劑及其配制42
• 3.2 實(shí)驗(yàn)方法42-49
• 3.2.1 引物設(shè)計(jì)42-44
• 3.2.2 基因合成44
• 3.2.3 2%瓊脂糖凝膠電泳44-45
• 3.2.4 目的基因的回收與純化45-46
• 3.2.5 目的基因克隆連接46-47
• 3.2.6 CaCl_2法制備大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞47
• 3.2.7 轉(zhuǎn)化大腸桿菌47
• 3.2.8 重組菌質(zhì)粒提取47-48
• 3.2.9 陽性克隆子雙酶切鑒定48-49
• 3.2.10 基因測(cè)序鑒定49
• 3.3 結(jié)果與分析49-52
• 3.3.1 全長(zhǎng)基因合成49
• 3.3.2 重組子雙酶切驗(yàn)證49-51
• 3.3.3 目的基因測(cè)序驗(yàn)證51-52
• 3.4 結(jié)論與討論52-54
• 第四章 抗菌肽在乳酸乳球菌中的分泌表達(dá)及作用54-76
• 4.1 實(shí)驗(yàn)材料56-59
• 4.1.1 實(shí)驗(yàn)菌種與質(zhì)粒56
• 4.1.2 實(shí)驗(yàn)主要儀器56
• 4.1.3 實(shí)驗(yàn)試劑及試劑盒56
• 4.1.4 培養(yǎng)基及其配制56-57
• 4.1.5 主要試劑及其配制57-59
• 4.2 實(shí)驗(yàn)方法59-66
• 4.2.1 目的抗菌肽基因提取59
• 4.2.2 乳酸菌質(zhì)粒DNA提取59
• 4.2.3 重組大腸桿菌mc1061的構(gòu)建59-60
• 4.2.4 重組大腸桿菌mc1061的鑒定60
• 4.2.5 乳酸菌感受態(tài)細(xì)胞的制備60-61
• 4.2.6 乳酸菌感受態(tài)細(xì)胞的電擊轉(zhuǎn)化61
• 4.2.7 轉(zhuǎn)化子的篩選61
• 4.2.8 轉(zhuǎn)化子的酶切及測(cè)序61-62
• 4.2.9 重組乳酸菌的誘導(dǎo)表達(dá)及提取62
• 4.2.10 上清表達(dá)產(chǎn)物的純化62
• 4.2.11 重組蛋白的電泳鑒定——Tricine-SDS-PAGE電泳62-64
• 4.2.12 重組蛋白免疫檢測(cè)——Western Blot和Dot Blot64-66
• 4.2.13 上清表達(dá)產(chǎn)物抑菌活性檢測(cè)66
• 4.3 結(jié)果與分析66-73
• 4.3.1 重組乳酸菌菌液PCR鑒定66-67
• 4.3.2 重組乳酸菌雙酶切鑒定67-68
• 4.3.3 重組乳酸菌測(cè)序鑒定68-69
• 4.3.4 蛋白凝膠電泳分析69-70
• 4.3.5 蛋白免疫檢測(cè)分析70-71
• 4.3.6 抑菌實(shí)驗(yàn)71-73
• 4.4 結(jié)論與討論73-76
• 第五章 結(jié)論與展望76-78
• 5.1 結(jié)論76
• 5.2 展望76-78
• 參考文獻(xiàn)78-88
• 在讀期間已經(jīng)發(fā)表和將要發(fā)表的論文88-89
• 致謝89-90

【共引文獻(xiàn)】

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1 王越;滲透壓補(bǔ)償性溶質(zhì)ECTOINE對(duì)酶穩(wěn)定性影響的研究[D];大連海事大學(xué);2011年

2 王立鵬;特征提取及分類算法在膜蛋白分類預(yù)測(cè)問題中的應(yīng)用[D];蘭州理工大學(xué);2010年

3 李蓓;蒙古馬毛色性狀相關(guān)基因多態(tài)性分析及組織表達(dá)研究[D];內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué);2011年

4 常華;鴨瘟病毒gE基因功能初步研究[D];四川農(nóng)業(yè)大學(xué);2011年

5 張靜;海帶線粒體及部分核基因組結(jié)構(gòu)特征研究[D];中國(guó)海洋大學(xué);2011年

6 黃金豐;α-螺旋型膜活性多肽對(duì)不同細(xì)胞膜的構(gòu)效關(guān)系及作用機(jī)理研究[D];吉林大學(xué);2011年

7 佟平;雞蛋卵轉(zhuǎn)鐵蛋白線性表位定位及熱加工對(duì)其結(jié)構(gòu)與過敏原性的影響[D];南昌大學(xué);2011年

8 卿玉玲;HBsAg與GM-CSF融合乙型肝炎DNA疫苗的基礎(chǔ)研究[D];重慶醫(yī)科大學(xué);2002年

9 楊清武;TLR4在LPS激活內(nèi)皮細(xì)胞中的作用及其可溶性受體表達(dá)[D];第三軍醫(yī)大學(xué);2002年

10 夏榮;白細(xì)胞介素—6誘導(dǎo)相關(guān)新基因的功能研究[D];中國(guó)人民解放軍第一軍醫(yī)大學(xué);2003年

中國(guó)碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前9條

1 廖學(xué)文;雜合抗菌肽LFM-3的分子設(shè)計(jì)及其在畢赤酵母中的表達(dá)[D];南京農(nóng)業(yè)大學(xué);2012年

2 李蕊;脂多糖誘導(dǎo)綿羊肺泡巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組分析和NK-Lysin、GM-CSF表達(dá)及生物學(xué)功能研究[D];石河子大學(xué);2013年

3 孫s

本文編號(hào)：293636