本文關(guān)鍵詞：尼克酰胺磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶在A549細(xì)胞發(fā)生上皮—間質(zhì)轉(zhuǎn)化中的作用，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：研究背景： 尼克酰胺磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(nicotinamide phosphoribosyltransferase, NAMPT),是哺乳動(dòng)物細(xì)胞尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸(Nicotinamide adenine dinucleotide, NAD)補(bǔ)救合成途徑的限速酶,而NAD是細(xì)胞物質(zhì)能量代謝的重要輔酶。研究發(fā)現(xiàn),NAMPT與腫瘤的關(guān)系非常密切,相比于正常細(xì)胞,腫瘤細(xì)胞對(duì)物質(zhì)、能量的需求更高,因而對(duì)NAMPT的需求也更高。臨床研究發(fā)現(xiàn),許多腫瘤患者血清中的NAMPT水平顯著升高,且隨著腫瘤惡性程度的加深而增加,與預(yù)后呈負(fù)相關(guān)。有研究者認(rèn)為可以將患者血清中的NAMPT水平作為評(píng)估腫瘤惡性程度的生物標(biāo)記物。還有研究發(fā)現(xiàn),NAMPT能夠促進(jìn)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞增殖及管腔形成,通過誘導(dǎo)ERK通路(Extracellular regulated protein kinase, ERK)和基質(zhì)金屬蛋白酶(Matrix metalloproteinases, MMP2/9)的活化,促進(jìn)血管增生,因而認(rèn)為NAMPT對(duì)于腫瘤細(xì)胞的遷移有促進(jìn)作用,這提示NAMPT與腫瘤的發(fā)生發(fā)展具有密切的聯(lián)系。目前,NAMPT特異性抑制劑FK866已經(jīng)進(jìn)入Ⅱ期臨床試驗(yàn),FK866能通過特異性抑制NAMPT酶活性,使NAD的合成減少,從而導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞死亡。研究者認(rèn)為,FK866是極具應(yīng)用前景的抗腫瘤藥物。 腫瘤的侵襲與轉(zhuǎn)移與多種因素有關(guān),在惡性腫瘤的發(fā)展過程中,上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(Epithelial-Mesenchymal Transition, EMT)是腫瘤發(fā)生侵襲和向遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移的一個(gè)重要步驟。然而,NAMPT及其抑制劑FK866對(duì)腫瘤細(xì)胞的侵襲與轉(zhuǎn)移是否有影響,卻少有研究報(bào)道。本研究中,我們應(yīng)用FK866抑制細(xì)胞NAMPT酶活性、細(xì)胞外直接給予NAMPT蛋白作處理因素,觀察這些處理對(duì)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株A549細(xì)胞發(fā)生EMT的影響,并初步探討這些處理影響A549細(xì)胞發(fā)生EMT的機(jī)制。 研究目的： 觀察尼克酰胺磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(NAMPT)抑制劑FK866及細(xì)胞外NAMPT在A549細(xì)胞發(fā)生EMT中的作用,并初步探討以上處理影響A549細(xì)胞發(fā)生EMT的機(jī)制。 研究方法： 1.探討抑制NAMPT酶活性對(duì)A549細(xì)胞發(fā)生EMT影響： (1)使用TGF-β1誘導(dǎo)A549細(xì)胞發(fā)生EMT,建立EMT模型；采用RT-qPCR方法檢測(cè)FK866處理后,模型表達(dá)與EMT相關(guān)分子標(biāo)記物E-cadherin、vimentin和α-SMA的mRNA的情況； (2)采用RT-qPCR方法檢測(cè)A549細(xì)胞以FK866不同濃度不同時(shí)間作用后,表達(dá)EMT相關(guān)分子標(biāo)記物E-cadherin、vimentin和α-SMA的mRNA的情況； (3)以RT-qPCR方法檢測(cè)FK866作用后A549細(xì)胞的TGF-β1表達(dá)； (4)以NAMPT的底物NMN(模擬NAMPT酶活性增高)預(yù)處理A549細(xì)胞后,再以FK866給藥處理,觀察NMN能否逆轉(zhuǎn)FK866引起的EMT相關(guān)分子的表達(dá)變化； (5)以Western blotting檢測(cè)FK866處理A549細(xì)胞不同時(shí)間,細(xì)胞ERK1/2及p-ERK1/2的表達(dá)；并使用ERK抑制劑U0126預(yù)處理,以進(jìn)一步確證ERK通路激活參與調(diào)控FK866引起的A549細(xì)胞發(fā)生EMT； (6)以RT-qPCR方法檢測(cè)FK866作用后A549細(xì)胞中EMT轉(zhuǎn)錄因子Snaill, Slug, Twist的表達(dá)； 2.探討細(xì)胞外NAMPT對(duì)A549細(xì)胞發(fā)生EMT的影響： (1)以基因重組的人NAMPT野生型蛋白、酶活性位點(diǎn)突變型蛋白(NAMPT/H247A)處理A549細(xì)胞,以TGF-β1為陽性對(duì)照,采用RT-qPCR檢測(cè)細(xì)胞上皮化標(biāo)記物E-cadherin,間質(zhì)化標(biāo)記物vimentin和a-SMA的表達(dá)。 (2)使用ERK抑制劑U0126預(yù)處理后,檢測(cè)上皮化標(biāo)記物E-cadherin,間質(zhì)化標(biāo)記物vimentin和a-SMA的表達(dá)情況。 (3)以基因重組的人NAMPT蛋白野生型、酶活性位點(diǎn)突變型蛋白NAMPT/H247A (500ng/ml)處理A549細(xì)胞,采用RT-qPCR檢測(cè)細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子Snaill, Slug, Twist的表達(dá)。 研究結(jié)果： 1.抑制NAMPT酶活性可促進(jìn)A549細(xì)胞發(fā)生EMT (1) TGF-β1濃度依賴和時(shí)間依賴的誘導(dǎo)A549細(xì)胞發(fā)生EMT; FK866預(yù)處理并未能抑制TGF-β1誘導(dǎo)的EMT； (2)單獨(dú)使用FK866處理A549細(xì)胞后,細(xì)胞間質(zhì)化標(biāo)記物vimentin與a-SMA的mRNA表達(dá)呈時(shí)間依賴性的顯著升高； (3)FK86610nM單獨(dú)使用處理A549細(xì)胞后,細(xì)胞表達(dá)TGF-β1明顯下降,表明較高濃度的FK866誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生EMT其機(jī)制可能不涉及TGF-β1的上調(diào)表達(dá)； (4)NMN能夠顯著逆轉(zhuǎn)FK866引起的EMT相關(guān)標(biāo)記物的表達(dá)變化,提示FK866促進(jìn)細(xì)胞發(fā)生EMT的機(jī)制涉及其對(duì)NAMPT酶活性的抑制； (5)隨著FK866作用時(shí)間的延長(zhǎng),細(xì)胞p-ERK1/2的表達(dá)顯著增加,且U0126預(yù)處理能夠顯著逆轉(zhuǎn)FK866引起的EMT標(biāo)記物vimentin和a-SMA的mRNA表達(dá)上調(diào)；提示FK866促進(jìn)細(xì)胞發(fā)生EMT的機(jī)制涉及ERK通路激活； (6)FK866(1nM)處理A549細(xì)胞72h,可顯著上調(diào)轉(zhuǎn)錄因子Snaill, Slug, Twist的表達(dá),提示FK866促進(jìn)細(xì)胞發(fā)生EMT的機(jī)制涉及EMT相關(guān)分子轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)節(jié)。 2.細(xì)胞外NAMPT (eNAMPT)可促進(jìn)A549細(xì)胞發(fā)生EMT (1)人基因重組的NAMPT蛋白野生型(500ng/ml)和酶活性位點(diǎn)突變型蛋白NAMPT/H247A (500ng/ml)處理均可引起A549細(xì)胞上皮標(biāo)記物E-cadherin的mRNA的表達(dá)顯著下降,間質(zhì)化標(biāo)記物vimentin的mRNA的表達(dá)顯著增加； (2)ERK抑制劑U0126預(yù)處理能夠顯著逆轉(zhuǎn)eNAMPT引起的E-cadherin和vimentin的mRNA表達(dá)變化； (3)人基因重組的NAMPT蛋白野生型及酶活性位點(diǎn)突變型蛋白(NAMPT/H247A)(500ng/ml)處理細(xì)胞后,轉(zhuǎn)錄因子Snail, Slug, Twist的表達(dá)均顯著增加。 結(jié)論： 1.NAMPT酶活性抑制劑FK866可誘導(dǎo)A549細(xì)胞發(fā)生EMT,其作用機(jī)制涉及對(duì)NAMPT酶活性抑制、ERK通路激活以及EMT相關(guān)分子轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)節(jié)。 2.細(xì)胞外較高濃度的NAMPT也可誘導(dǎo)A549細(xì)胞發(fā)生EMT,但其作用不依賴于NAMPT的酶活性,其作用機(jī)制也涉及ERK通路激活以及EMT相關(guān)分子轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)節(jié)。
【關(guān)鍵詞】：上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化 A549細(xì)胞 腫瘤 NAMPT FK866
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R96
【目錄】：

• 致謝4-5
• 摘要5-9
• Abstract9-13
• 縮略詞表13-15
• 1. 引言15-19
• 2. 實(shí)驗(yàn)材料19-24
• 3. 實(shí)驗(yàn)方法24-30
• 4. 實(shí)驗(yàn)結(jié)果30-61
• 5. 討論61-66
• 參考文獻(xiàn)66-72
• 綜述72-84
• 參考文獻(xiàn)80-84
• 作者簡(jiǎn)歷及在讀期間所取得的科研成果84

【共引文獻(xiàn)】

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  本文關(guān)鍵詞：尼克酰胺磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶在A549細(xì)胞發(fā)生上皮—間質(zhì)轉(zhuǎn)化中的作用，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號(hào)：268581