本文關(guān)鍵詞：氧化石墨烯熒光探針用于核酸酶的熱動(dòng)力學(xué)分析和藥物篩選，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：生物分子的快速檢測(cè)是現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)和分析化學(xué)領(lǐng)域的重要研究課題之一。與一些成本高,實(shí)驗(yàn)過(guò)程冗雜的傳統(tǒng)生物技術(shù)相比,熒光分子探針技術(shù)是一種成本低廉、靈敏度高、特異性強(qiáng),操作簡(jiǎn)單的研究手段。它能將檢測(cè)的復(fù)雜生物分子信息轉(zhuǎn)變?yōu)橐子跈z測(cè)的熒光信號(hào),因此被廣泛地應(yīng)用于各種生物分子如蛋白質(zhì)、核酸、酶等的快速檢測(cè)中。然而,現(xiàn)有的熒光探針技術(shù)在應(yīng)用中存在一些缺陷：如熒光體系的背景信號(hào)高、所用材料的生物相容性差、實(shí)驗(yàn)結(jié)果欠穩(wěn)定等。因此進(jìn)一步改進(jìn)和發(fā)展新型熒光分子探針技術(shù)具有極其重要的應(yīng)用價(jià)值。近年來(lái),科學(xué)家們發(fā)現(xiàn)氧化石墨烯(Graphene oxide,GO)作為一種通用熒光淬滅劑具有吸附單鏈核酸的能力,此外,吸附于GO表面的功能核酸分子具有較高的細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率、低細(xì)胞毒性以及較強(qiáng)的生物穩(wěn)定性。因此,GO結(jié)合熒光分子探針技術(shù)可以降低背景信號(hào)、改善生物相容性、提高靈敏度等,從而被廣泛應(yīng)用于細(xì)胞內(nèi)特定基因及代謝物的檢測(cè)和成像等生命活動(dòng)。本文將GO與核酸酶本身固有的生物學(xué)特性相結(jié)合,利用氧化石墨烯熒光探針技術(shù)開(kāi)展了一系列快速,簡(jiǎn)單,高特異性的核酸酶活性與動(dòng)力學(xué)分析以及抑制劑的體內(nèi)外篩選研究。本文的主要研究?jī)?nèi)容如下：1.基于氧化石墨烯熒光技術(shù)用于綠豆核酸酶熱動(dòng)力分析和抑制劑的篩選基于綠豆核酸酶誘導(dǎo)單鏈DNA斷裂以及氧化石墨烯對(duì)不同長(zhǎng)度的單鏈DNA親和力不同而設(shè)計(jì)了基于熒光探針技術(shù)對(duì)綠豆核酸酶的定量定性分析實(shí)驗(yàn)。在通優(yōu)化的酶促反應(yīng)條件下,綠豆核酸酶線性檢測(cè)范圍為2×10-4-4×10-2unit/mL,檢測(cè)下限為1×10-4 unit/mL,最適GO濃度為15μg/ml,體系的最適酶反應(yīng)濃度為8×10-2unit/mL,在37℃下反應(yīng)30min最為合適。該方法進(jìn)一步用于考察不同抗生素和重金屬離子對(duì)酶活力的影響。其檢測(cè)結(jié)果得到了瓊脂糖凝膠電泳法的驗(yàn)證。這種靈敏度高的檢測(cè)方法適合綠豆核酸酶體內(nèi)、外的定量定性分析。有趣的是,我們發(fā)現(xiàn)：抑制綠豆體內(nèi)核酸酶活性可導(dǎo)致抑制綠豆芽的生長(zhǎng)。2.基于氧化石墨烯熒光技術(shù)對(duì)脫氧核酸酶Ⅰ ( DNase Ⅰ)的活性分析DNase Ⅰ是一種可以消化單鏈或雙鏈DNA產(chǎn)生單脫氧核苷酸或單鏈或雙鏈的寡核苷酸,本章利用氧化石墨烯這種通用淬滅劑對(duì)不同長(zhǎng)度DNA親和力不同的特點(diǎn)以及熒光分子探針技術(shù)選擇性高,靈敏度高,操作簡(jiǎn)易的優(yōu)點(diǎn)來(lái)開(kāi)展DNase Ⅰ的熱動(dòng)力分析以及體內(nèi)外抑制劑的篩選。本文從多種不同的單鏈或雙鏈熒光分子探針中篩選得到了信背比最高的探針,進(jìn)一步將其用于DNase Ⅰ的定量分析。在優(yōu)化檢測(cè)條件下,得到DNase I酶濃度的范圍為1×104到6×10-2unit/mL,檢測(cè)下限為0.5×10-4unit/mL。開(kāi)展進(jìn)一步研究DNA酶Ⅰ活性抑制劑篩選結(jié)果發(fā)現(xiàn)：慶大霉素和卡那霉素具有抑制DNA酶Ⅰ活性的能力,紅霉素為激活劑；AS3+、Pb2+、Cu2+、 Hg2+、Cd2+能抑制酶活性,而Mg2+和Mn2+作用效果相反。該方法還被用于腫瘤和血清中的DNA酶Ⅰ定量定性檢測(cè),結(jié)果表明：該方法可用于1 μg總蛋白中的DNase Ⅰ活性檢測(cè)。3.GO-嵌合核酸熒光探針用于RNase H活性分析方法的建立及其應(yīng)用本章以DNA-RNA異源雙鏈核酸探針作為酶促底物和信號(hào)報(bào)告分子,結(jié)合氧化石墨烯猝滅熒光的能力建立一種RNase H活性分析方法,將其用于RNase H的熱動(dòng)力學(xué)考察以及RNase H的抑制劑篩選。結(jié)果表明這種RNase H活性檢測(cè)線性區(qū)間為1.0×10-4-4.0×10-2unit/mL,檢測(cè)下限可以達(dá)到0.5×10-4 unit/mL;抑制劑篩選結(jié)果發(fā)現(xiàn)慶大霉素、鏈霉素以及Hg2+等重金屬離子均能顯著抑制RNase H活性。最后將該方法用于微量復(fù)雜生物樣品中的RNase H表達(dá)水平分析。
【關(guān)鍵詞】：GO 熒光探針 MBN DNase I RNase H 胃癌
【學(xué)位授予單位】：湖南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R91;Q503
【目錄】：

• 摘要5-7
• Abstract7-13
• 第1章 緒論13-21
• 1.1 熒光分析技術(shù)的概述13
• 1.2 熒光探針技術(shù)的研究現(xiàn)狀13-16
• 1.2.1 熒光探針技術(shù)的概述13-14
• 1.2.2 熒光探針技術(shù)的原理與探針?lè)N類14-15
• 1.2.3 熒光探針技術(shù)的應(yīng)用及發(fā)展15-16
• 1.3 生物傳感器的概述16
• 1.3.1 生物傳感器簡(jiǎn)介及其結(jié)構(gòu)16
• 1.3.2 熒光生物傳感器的發(fā)展16
• 1.4 石墨烯的概述16-18
• 1.4.1 石墨烯簡(jiǎn)介及制備16-17
• 1.4.2 石墨烯的應(yīng)用17
• 1.4.3 基于氧化石墨烯的熒光探針技術(shù)17-18
• 1.5 本文的選題背景和研究意義18-19
• 1.6 本文擬開(kāi)展的工作19-21
• 第2章 基于GO-熒光探針技術(shù)用MBN的檢測(cè)與分析21-36
• 2.1 前言21
• 2.2 實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備部分21-23
• 2.2.1 基于氧化石墨烯分子探針技術(shù)檢測(cè)綠豆酶的實(shí)驗(yàn)原理21-23
• 2.2.2 試劑與儀器23
• 2.3 實(shí)驗(yàn)方法部分23-27
• 2.3.1 溶液的配制與實(shí)驗(yàn)材料及其器皿的準(zhǔn)備23-24
• 2.3.2 熒光強(qiáng)度測(cè)定的方法24
• 2.3.3 綠豆核酸酶的可行性分析以及添加順序的考察24
• 2.3.4 GO淬滅熒光效率的考察24
• 2.3.5 綠豆核酸酶動(dòng)力學(xué)的研究24-25
• 2.3.6 綠豆核酸酶抑制劑的篩選25
• 2.3.7 銀染的方法驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性25
• 2.3.8 綠豆芽培養(yǎng)25-26
• 2.3.9 綠豆芽細(xì)胞裂解液的提取26
• 2.3.10 蛋白質(zhì)濃度的測(cè)定26
• 2.3.11 細(xì)胞提取液的檢測(cè)26-27
• 2.4 結(jié)果與討論27-35
• 2.4.1 可行性分析27
• 2.4.2 GO濃度的優(yōu)化27-28
• 2.4.3 酶濃度的優(yōu)化以及反應(yīng)時(shí)間的優(yōu)化28-30
• 2.4.4 底物濃度對(duì)酶促反應(yīng)影響30-31
• 2.4.5 MNB的動(dòng)力學(xué)曲線的建立31
• 2.4.6 抑制劑的篩選31-32
• 2.4.7 金屬離子對(duì)MBN活力的影響32-33
• 2.4.8 綠豆芽的培育以及抑制劑的篩選33-34
• 2.4.9 熒光法檢測(cè)綠豆芽提取物中MBN34-35
• 2.5 小結(jié)35-36
• 第3章 基于GO-熒光探針技術(shù)用于DNase Ⅰ的定量分析36-51
• 3.1 前言36
• 3.2 實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備部分36-39
• 3.2.1 基于GO-熒光探針技術(shù)檢測(cè)DNase Ⅰ活性的實(shí)驗(yàn)原理37-38
• 3.2.2 儀器和試劑38-39
• 3.3 實(shí)驗(yàn)方法部分39-41
• 3.3.1 溶液的配制與實(shí)驗(yàn)器皿的處理39
• 3.3.2 熒光強(qiáng)度測(cè)定的方法39
• 3.3.3 DNase Ⅰ的可行性分析以及添加順序的考察39-40
• 3.3.4 GO淬滅熒光效率的考察40
• 3.3.5 DNase Ⅰ熱動(dòng)力學(xué)的研究40
• 3.3.6 DNase Ⅰ抑制劑的篩選40
• 3.3.7 銀染的方法驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性40-41
• 3.3.8 腫瘤細(xì)胞的培養(yǎng)與處理方法41
• 3.3.9 檢測(cè)復(fù)雜樣品中的DNase Ⅰ的活性41
• 3.4 結(jié)果與討論41-50
• 3.4.1 不同熒光探針對(duì)DNase Ⅰ檢測(cè)的信背比考察41-42
• 3.4.2 關(guān)于GO淬滅效率的考察42-44
• 3.4.3 酶體系實(shí)驗(yàn)以及反應(yīng)時(shí)間的優(yōu)化44-45
• 3.4.4 酶的熱動(dòng)力學(xué)分析45-46
• 3.4.5 抗生素對(duì)DNase Ⅰ活力的影響46-47
• 3.4.6 金屬離子的篩選以及濃度條件的考察47-48
• 3.4.7 結(jié)晶紫對(duì)DNase Ⅰ的影響考察48-49
• 3.4.8 胃癌細(xì)胞以及膠質(zhì)瘤細(xì)胞組織樣品的檢測(cè)49-50
• 3.4.9 血清樣品中DNase Ⅰ活性檢測(cè)50
• 3.5 小結(jié)50-51
• 第4章 基于GO-熒光探針的RNase H活性分析方法建立及其應(yīng)用51-64
• 4.1 前言51
• 4.2 實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備部分51-54
• 4.2.1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理51-53
• 4.2.2 試劑與儀器53-54
• 4.3 實(shí)驗(yàn)方法部分54-57
• 4.3.1 熒光檢測(cè)54
• 4.3.2 溶液的配制與實(shí)驗(yàn)器皿的處理54
• 4.3.3 RNase H活性實(shí)驗(yàn)54
• 4.3.4 RNase H的可行性分析以及添加順序的考察54-55
• 4.3.5 GO淬滅熒光效率的考察55
• 4.3.6 RNA酶H熱動(dòng)力學(xué)的研究55
• 4.3.7 RNase H抑制劑的篩選55
• 4.3.8 腫瘤細(xì)胞的培養(yǎng)與處理方法55-56
• 4.3.9 銀染的方法驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性56
• 4.3.10 檢測(cè)復(fù)雜樣品中的RNase H的活性56-57
• 4.4 結(jié)果與討論57-63
• 4.4.1 得到信噪比比較高的探針57
• 4.4.2 GO優(yōu)化以及淬滅效率的考察57-58
• 4.4.3 酶濃度的優(yōu)化58-59
• 4.4.4 反應(yīng)時(shí)間的優(yōu)化59
• 4.4.5 RNase H的熱動(dòng)力學(xué)研究59-60
• 4.4.6 金屬離子對(duì)RNase H活性的影響60-61
• 4.4.7 RNase H抑制劑的篩選61-62
• 4.4.8 細(xì)胞樣品和血清樣品RNase H含量的測(cè)定62-63
• 4.5 小結(jié)63-64
• 結(jié)論與展望64-65
• 參考文獻(xiàn)65-73
• 附錄 攻讀碩士學(xué)位期間參與發(fā)表論文和專利73-74
• 致謝74

  本文關(guān)鍵詞：氧化石墨烯熒光探針用于核酸酶的熱動(dòng)力學(xué)分析和藥物篩選，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號(hào)：268286