本文關鍵詞：氧化石墨烯熒光探針用于核酸酶的熱動力學分析和藥物篩選，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：生物分子的快速檢測是現(xiàn)代生物醫(yī)學和分析化學領域的重要研究課題之一。與一些成本高,實驗過程冗雜的傳統(tǒng)生物技術相比,熒光分子探針技術是一種成本低廉、靈敏度高、特異性強,操作簡單的研究手段。它能將檢測的復雜生物分子信息轉變?yōu)橐子跈z測的熒光信號,因此被廣泛地應用于各種生物分子如蛋白質、核酸、酶等的快速檢測中。然而,現(xiàn)有的熒光探針技術在應用中存在一些缺陷：如熒光體系的背景信號高、所用材料的生物相容性差、實驗結果欠穩(wěn)定等。因此進一步改進和發(fā)展新型熒光分子探針技術具有極其重要的應用價值。近年來,科學家們發(fā)現(xiàn)氧化石墨烯(Graphene oxide,GO)作為一種通用熒光淬滅劑具有吸附單鏈核酸的能力,此外,吸附于GO表面的功能核酸分子具有較高的細胞轉染效率、低細胞毒性以及較強的生物穩(wěn)定性。因此,GO結合熒光分子探針技術可以降低背景信號、改善生物相容性、提高靈敏度等,從而被廣泛應用于細胞內特定基因及代謝物的檢測和成像等生命活動。本文將GO與核酸酶本身固有的生物學特性相結合,利用氧化石墨烯熒光探針技術開展了一系列快速,簡單,高特異性的核酸酶活性與動力學分析以及抑制劑的體內外篩選研究。本文的主要研究內容如下：1.基于氧化石墨烯熒光技術用于綠豆核酸酶熱動力分析和抑制劑的篩選基于綠豆核酸酶誘導單鏈DNA斷裂以及氧化石墨烯對不同長度的單鏈DNA親和力不同而設計了基于熒光探針技術對綠豆核酸酶的定量定性分析實驗。在通優(yōu)化的酶促反應條件下,綠豆核酸酶線性檢測范圍為2×10-4-4×10-2unit/mL,檢測下限為1×10-4 unit/mL,最適GO濃度為15μg/ml,體系的最適酶反應濃度為8×10-2unit/mL,在37℃下反應30min最為合適。該方法進一步用于考察不同抗生素和重金屬離子對酶活力的影響。其檢測結果得到了瓊脂糖凝膠電泳法的驗證。這種靈敏度高的檢測方法適合綠豆核酸酶體內、外的定量定性分析。有趣的是,我們發(fā)現(xiàn)：抑制綠豆體內核酸酶活性可導致抑制綠豆芽的生長。2.基于氧化石墨烯熒光技術對脫氧核酸酶Ⅰ ( DNase Ⅰ)的活性分析DNase Ⅰ是一種可以消化單鏈或雙鏈DNA產生單脫氧核苷酸或單鏈或雙鏈的寡核苷酸,本章利用氧化石墨烯這種通用淬滅劑對不同長度DNA親和力不同的特點以及熒光分子探針技術選擇性高,靈敏度高,操作簡易的優(yōu)點來開展DNase Ⅰ的熱動力分析以及體內外抑制劑的篩選。本文從多種不同的單鏈或雙鏈熒光分子探針中篩選得到了信背比最高的探針,進一步將其用于DNase Ⅰ的定量分析。在優(yōu)化檢測條件下,得到DNase I酶濃度的范圍為1×104到6×10-2unit/mL,檢測下限為0.5×10-4unit/mL。開展進一步研究DNA酶Ⅰ活性抑制劑篩選結果發(fā)現(xiàn)：慶大霉素和卡那霉素具有抑制DNA酶Ⅰ活性的能力,紅霉素為激活劑；AS3+、Pb2+、Cu2+、 Hg2+、Cd2+能抑制酶活性,而Mg2+和Mn2+作用效果相反。該方法還被用于腫瘤和血清中的DNA酶Ⅰ定量定性檢測,結果表明：該方法可用于1 μg總蛋白中的DNase Ⅰ活性檢測。3.GO-嵌合核酸熒光探針用于RNase H活性分析方法的建立及其應用本章以DNA-RNA異源雙鏈核酸探針作為酶促底物和信號報告分子,結合氧化石墨烯猝滅熒光的能力建立一種RNase H活性分析方法,將其用于RNase H的熱動力學考察以及RNase H的抑制劑篩選。結果表明這種RNase H活性檢測線性區(qū)間為1.0×10-4-4.0×10-2unit/mL,檢測下限可以達到0.5×10-4 unit/mL;抑制劑篩選結果發(fā)現(xiàn)慶大霉素、鏈霉素以及Hg2+等重金屬離子均能顯著抑制RNase H活性。最后將該方法用于微量復雜生物樣品中的RNase H表達水平分析。
【關鍵詞】：GO 熒光探針 MBN DNase I RNase H 胃癌
【學位授予單位】：湖南大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R91;Q503
【目錄】：

• 摘要5-7
• Abstract7-13
• 第1章 緒論13-21
• 1.1 熒光分析技術的概述13
• 1.2 熒光探針技術的研究現(xiàn)狀13-16
• 1.2.1 熒光探針技術的概述13-14
• 1.2.2 熒光探針技術的原理與探針種類14-15
• 1.2.3 熒光探針技術的應用及發(fā)展15-16
• 1.3 生物傳感器的概述16
• 1.3.1 生物傳感器簡介及其結構16
• 1.3.2 熒光生物傳感器的發(fā)展16
• 1.4 石墨烯的概述16-18
• 1.4.1 石墨烯簡介及制備16-17
• 1.4.2 石墨烯的應用17
• 1.4.3 基于氧化石墨烯的熒光探針技術17-18
• 1.5 本文的選題背景和研究意義18-19
• 1.6 本文擬開展的工作19-21
• 第2章 基于GO-熒光探針技術用MBN的檢測與分析21-36
• 2.1 前言21
• 2.2 實驗準備部分21-23
• 2.2.1 基于氧化石墨烯分子探針技術檢測綠豆酶的實驗原理21-23
• 2.2.2 試劑與儀器23
• 2.3 實驗方法部分23-27
• 2.3.1 溶液的配制與實驗材料及其器皿的準備23-24
• 2.3.2 熒光強度測定的方法24
• 2.3.3 綠豆核酸酶的可行性分析以及添加順序的考察24
• 2.3.4 GO淬滅熒光效率的考察24
• 2.3.5 綠豆核酸酶動力學的研究24-25
• 2.3.6 綠豆核酸酶抑制劑的篩選25
• 2.3.7 銀染的方法驗證實驗的準確性25
• 2.3.8 綠豆芽培養(yǎng)25-26
• 2.3.9 綠豆芽細胞裂解液的提取26
• 2.3.10 蛋白質濃度的測定26
• 2.3.11 細胞提取液的檢測26-27
• 2.4 結果與討論27-35
• 2.4.1 可行性分析27
• 2.4.2 GO濃度的優(yōu)化27-28
• 2.4.3 酶濃度的優(yōu)化以及反應時間的優(yōu)化28-30
• 2.4.4 底物濃度對酶促反應影響30-31
• 2.4.5 MNB的動力學曲線的建立31
• 2.4.6 抑制劑的篩選31-32
• 2.4.7 金屬離子對MBN活力的影響32-33
• 2.4.8 綠豆芽的培育以及抑制劑的篩選33-34
• 2.4.9 熒光法檢測綠豆芽提取物中MBN34-35
• 2.5 小結35-36
• 第3章 基于GO-熒光探針技術用于DNase Ⅰ的定量分析36-51
• 3.1 前言36
• 3.2 實驗準備部分36-39
• 3.2.1 基于GO-熒光探針技術檢測DNase Ⅰ活性的實驗原理37-38
• 3.2.2 儀器和試劑38-39
• 3.3 實驗方法部分39-41
• 3.3.1 溶液的配制與實驗器皿的處理39
• 3.3.2 熒光強度測定的方法39
• 3.3.3 DNase Ⅰ的可行性分析以及添加順序的考察39-40
• 3.3.4 GO淬滅熒光效率的考察40
• 3.3.5 DNase Ⅰ熱動力學的研究40
• 3.3.6 DNase Ⅰ抑制劑的篩選40
• 3.3.7 銀染的方法驗證實驗的準確性40-41
• 3.3.8 腫瘤細胞的培養(yǎng)與處理方法41
• 3.3.9 檢測復雜樣品中的DNase Ⅰ的活性41
• 3.4 結果與討論41-50
• 3.4.1 不同熒光探針對DNase Ⅰ檢測的信背比考察41-42
• 3.4.2 關于GO淬滅效率的考察42-44
• 3.4.3 酶體系實驗以及反應時間的優(yōu)化44-45
• 3.4.4 酶的熱動力學分析45-46
• 3.4.5 抗生素對DNase Ⅰ活力的影響46-47
• 3.4.6 金屬離子的篩選以及濃度條件的考察47-48
• 3.4.7 結晶紫對DNase Ⅰ的影響考察48-49
• 3.4.8 胃癌細胞以及膠質瘤細胞組織樣品的檢測49-50
• 3.4.9 血清樣品中DNase Ⅰ活性檢測50
• 3.5 小結50-51
• 第4章 基于GO-熒光探針的RNase H活性分析方法建立及其應用51-64
• 4.1 前言51
• 4.2 實驗準備部分51-54
• 4.2.1 實驗設計原理51-53
• 4.2.2 試劑與儀器53-54
• 4.3 實驗方法部分54-57
• 4.3.1 熒光檢測54
• 4.3.2 溶液的配制與實驗器皿的處理54
• 4.3.3 RNase H活性實驗54
• 4.3.4 RNase H的可行性分析以及添加順序的考察54-55
• 4.3.5 GO淬滅熒光效率的考察55
• 4.3.6 RNA酶H熱動力學的研究55
• 4.3.7 RNase H抑制劑的篩選55
• 4.3.8 腫瘤細胞的培養(yǎng)與處理方法55-56
• 4.3.9 銀染的方法驗證實驗的準確性56
• 4.3.10 檢測復雜樣品中的RNase H的活性56-57
• 4.4 結果與討論57-63
• 4.4.1 得到信噪比比較高的探針57
• 4.4.2 GO優(yōu)化以及淬滅效率的考察57-58
• 4.4.3 酶濃度的優(yōu)化58-59
• 4.4.4 反應時間的優(yōu)化59
• 4.4.5 RNase H的熱動力學研究59-60
• 4.4.6 金屬離子對RNase H活性的影響60-61
• 4.4.7 RNase H抑制劑的篩選61-62
• 4.4.8 細胞樣品和血清樣品RNase H含量的測定62-63
• 4.5 小結63-64
• 結論與展望64-65
• 參考文獻65-73
• 附錄 攻讀碩士學位期間參與發(fā)表論文和專利73-74
• 致謝74

  本文關鍵詞：氧化石墨烯熒光探針用于核酸酶的熱動力學分析和藥物篩選，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：268286