本文關(guān)鍵詞：免疫毒素T-CUS的制備及其體外抗乳腺癌活性研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的 免疫毒素(Immunotoxins,IT)又稱為生物導(dǎo)彈,是由單克隆抗體連接一定量的細(xì)胞毒素(Cytotoxin,CTX)制成的一種免疫復(fù)合物,是一類能定向攻擊靶細(xì)胞的藥物。本實驗研究制備曲妥珠單克隆抗體(Trastuzumab,T,商品名為赫賽汀)與南瓜蛋白(Cucurmosin,CUS)的偶聯(lián)物即免疫毒素(T-CUS),旨在充分利用前者的靶向、選擇性強和后者活性高的特點,消除前者療效偏低和后者副作用偏大等缺陷;檢測制備的免疫毒素對靶細(xì)胞的免疫活性和體外殺傷作用,尋求新的治療HER-2陽性乳腺癌的方法。方法 1免疫毒素的制備:先后使用SPDP、2-IT作為交聯(lián)劑,用化學(xué)交聯(lián)法制備兩種免疫毒素即T-CUS-PDP和T-CUS-2-IT。2免疫毒素的純化:用Ni Sepharose 6 Fast Flow親和層析和Sp-Sepharose Fast Flow陽離子交換柱進行純化,并用SDS-PAGE進行電泳鑒定,用BCA法進行定量。3免疫毒素結(jié)合活性測定:用細(xì)胞ELISA法檢測T-CUS-PDP、T-CUS-2-IT對靶細(xì)胞的結(jié)合活性。4用SRB法比較CUS、CUS-PDP、CUS-2-IT對乳腺癌細(xì)胞BT-474和HCC1937的體外殺傷作用。5用SRB法比較T、T-PDP的高濃度組和低濃度組分別對乳腺癌細(xì)胞BT-474和HCC1937的體外殺傷作用。6用SRB法比較CUS、T、T-CUS-PDP、T-CUS-2-IT及CUS與T聯(lián)合對乳腺癌細(xì)胞BT-474和HCC1937的體外殺傷作用。結(jié)果 1用SPDP、2-IT作為交聯(lián)劑通過化學(xué)交聯(lián)法制備的免疫毒素經(jīng)Ni Sepharose 6 Fast Flow親和層析和Sp-Sepharose Fast Flow陽離子交換柱純化后通過SDS-PAGE鑒定,在抗體上方有出現(xiàn)較明顯的免疫毒素的條帶,免疫毒素T-CUS-PDP、T-CUS-2-IT制備成功。2制備的兩種免疫毒素與單純曲妥珠單抗相比,與BT-474細(xì)胞的結(jié)合活性沒有明顯變化,能保持原有免疫活性。3 CUS用SPDP交聯(lián)后,對BT-474細(xì)胞的IC50從0.325μg/ml升至1.736μg/ml,活性損失了80%左右;對HCC1937細(xì)胞的IC50從0.298μg/ml升至0.904μg/ml,活性損失了70%左右;實驗換用2-IT作為交聯(lián)劑后,對BT-474細(xì)胞的IC50從0.325μg/ml升至0.365μg/ml,對HCC1937細(xì)胞的IC50從0.298μg/ml升至0.316μg/ml,活性均保留了約90%。4曲妥珠單抗用SPDP交聯(lián)后,仍保留了對BT-474細(xì)胞的大部分活性。T對BT-474細(xì)胞的IC50為0.124μg/ml,T-PDP對BT-474細(xì)胞的IC50為0.143μg/ml,T-PDP仍保留了抗體大部分的活性。另外不管是低濃度組還是高濃度組,T和T-PDP對HCC1937細(xì)胞都沒有明顯的殺傷作用,在實驗所設(shè)濃度下達(dá)不到半數(shù)抑制作用。5免疫毒素T-CUS-PDP對BT-474細(xì)胞的IC50為0.011μg/ml,按質(zhì)量濃度計算,比CUS高了約30倍,比T高了約10倍;T-CUS-2-IT對BT-474細(xì)胞的IC50為0.008μg/ml,比CUS高了約40倍,比T高了約16倍。CUS與T兩者聯(lián)合用藥實驗結(jié)果表明,免疫毒素對BT-474細(xì)胞的作用不是T與CUS兩種藥物單獨作用的簡單加和,曲妥珠單抗連接CUS可以顯著提高對乳腺癌BT-474細(xì)胞的殺傷力。免疫毒素T-CUS-PDP和T-CUS-2-IT在實驗所設(shè)的相同的濃度梯度范圍內(nèi),對HCC1937細(xì)胞沒有明顯的殺傷作用。結(jié)論 1用SPDP、2-IT作為交聯(lián)劑可成功構(gòu)建由T和CUS結(jié)合而成的免疫毒素。2免疫毒素的純化不是一個很簡單的過程,免疫毒素徹底分離純化的方法須在今后的研究中不斷探尋。3 T-CUS-PDP,T-CUS-2-IT的免疫活性與偶聯(lián)前比無明顯差異,能夠保持原有活性。4用SPDP交聯(lián)的CUS比用2-IT交聯(lián)的CUS活性下降明顯,但用兩者與T制備的免疫毒素對BT-474細(xì)胞的活性均有顯著提高,且用2-IT交聯(lián)得到T-CUS-2-IT活性提高更多。本研究為探尋新的治療HER-2陽性乳腺癌的方法提供了參考。
【關(guān)鍵詞】：乳腺癌 曲妥珠單抗 南瓜蛋白 免疫毒素 體外殺傷作用
【學(xué)位授予單位】：福建醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R943;R96
【目錄】：

• 英文縮略詞表6-7
• 中文摘要7-9
• 英文摘要9-11
• 前言11-14
• 第一部分 免疫毒素T-CUS的制備及鑒定14-29
• 1 材料14-16
• 1.1 藥物與主要試劑14
• 1.2 主要儀器14-15
• 1.3 有關(guān)溶液的配置15-16
• 2 方法16-21
• 2.1 用SPDP作為交聯(lián)劑制備免疫毒素T-CUS-PDP16-17
• 2.2 用 2-IT作為交聯(lián)劑制備免疫毒素T-CUS2IT17
• 2.3 免疫毒素的純化17-19
• 2.4 免疫毒素的鑒定19-21
• 3 結(jié)果21-26
• 4 討論26-28
• 5 小結(jié)28-29
• 第二部分 細(xì)胞培養(yǎng)及T-CUS-PDP、T-CUS2IT免疫活性的測定29-37
• 1 材料29-30
• 1.1 藥物及試劑29
• 1.2 細(xì)胞株29
• 1.3 儀器29
• 1.4 有關(guān)溶液的配置29-30
• 2 方法30-32
• 2.1 細(xì)胞培養(yǎng)30-31
• 2.2 細(xì)胞ELISA法檢測免疫毒素的免疫活性31-32
• 3 結(jié)果32-35
• 4 討論35-36
• 5 小結(jié)36-37
• 第三部分 免疫毒素體外抗乳腺癌活性研究37-52
• 1 材料37-38
• 1.1 藥物及試劑37
• 1.2 細(xì)胞株37
• 1.3 儀器37
• 1.4 有關(guān)溶液的配置37-38
• 2 方法38-39
• 2.1 SRB法實驗步驟38
• 2.2 CUS及CUS與兩種交聯(lián)劑交聯(lián)后活性測定38-39
• 2.3 曲妥珠單抗及與SPDP交聯(lián)后活性測定39
• 2.4 CUS、T、T-CUS-PDP和T-CUS2IT及CUS與T聯(lián)合用藥對靶細(xì)胞的殺傷作用39
• 2.5 統(tǒng)計學(xué)處理39
• 3 結(jié)果39-50
• 4 討論50-52
• 5 結(jié)論52
• 參考文獻52-56
• 文獻綜述56-62
• 參考文獻60-62
• 致謝62

【參考文獻】

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  本文關(guān)鍵詞：免疫毒素T-CUS的制備及其體外抗乳腺癌活性研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

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本文編號：268310