本文關鍵詞：γ-多聚谷氨酸對糖脂嫁接物膠束介導基因轉染的影響，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：殼聚糖-硬脂酸膠束(Chitosan-g-stearic acid, CS)具有較強的腫瘤細胞攝取能力和細胞核轉運能力,其表面正電荷可有效密接質粒DNA (Plasmid DNA, pDNA),實現(xiàn)體內(nèi)外基因有效轉染和抗腫瘤療效。前期研究結果表明,CS嫁接物膠束包封治療基因進入靶細胞后,遞送系統(tǒng)的內(nèi)涵體快速逃逸和治療基因的有效釋放,是制約其基因轉染效率的主因。為實現(xiàn)遞送系統(tǒng)在靶細胞內(nèi)的內(nèi)涵體快速逃逸以及基因藥物的有效釋放,本研究構建殼聚糖-硬脂酸嫁接物/聚乙二醇化多聚谷氨酸/pDNA三元基因遞送系統(tǒng),考察聚乙二醇化多聚谷氨酸(Poly(ethylene glycol)-b-poly(γ-glutamic acid), PG)的引入對轉染效率的影響、研究其相應的細胞攝取、內(nèi)涵體逃逸和pDNA釋放等過程的相關機理。本研究以18.0 kDa的殼聚糖(Chitosan)為原料,以碳二亞胺(1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimide, EDC)為交聯(lián)耦合劑,通過CS側鏈上的氨基和硬脂酸(Stearic acid, SA)上的羧基酰胺反應,合成CS。通過席夫反應在CS上鍵合聚乙二醇(Poly(ethylene glycol), PEG),合成聚乙二醇化的糖脂嫁接物(PEGylated chitosan-g-stearic acid, PCS)。核磁共振氫譜確證CS和PCS嫁接物的化學結構；三硝基苯磺酸法測定氨基取代度；芘熒光法測定臨界膠束濃度；動態(tài)光散射法測定嫁接物膠束的粒徑和表面電位；透射電鏡觀察膠束的大小和形態(tài)學特征。引入陰離子多肽PG,分別構建CS/pDNA, PCS/pDNA二元和CS/PG/pDNA三元基因遞送系統(tǒng)。測定基因遞送系統(tǒng)的粒徑和表面電位,通過透射電鏡觀察其粒子大小和形態(tài)；凝膠電泳分析嫁接物膠束對pDNA的密接能力,以及DNase Ⅰ酶保護能力。以編碼增強型綠色熒光蛋白pEGFP-C1為報告基因,以人胚腎細胞HEK293作為模型細胞,用熒光倒置顯微鏡觀察綠色熒光蛋白的表達,用FC定量測定其轉染效率,比較二元、三元基因遞送系統(tǒng)轉染效率的差異；以食管癌細胞EC-1作為模型細胞,通過三種不同的復合方式分別制備CS/PG/pDNA-Ⅰ、 CS/PG/pDNA-Ⅱ和CS/PG/pDNA-Ⅲ三元基因遞送系統(tǒng),用激光共聚焦顯微鏡(Confocal laser scanning microscope, CLSM)觀察綠色熒光蛋白的表達,用FC定量測定其轉染效率,比較和總結不同三元基因遞送系統(tǒng)轉染效率的差異和特點。MTT法考察遞送系統(tǒng)及其對應載體的細胞毒性。用四甲基異硫氰酸羅丹明B (Rhodamine B isothiocyanate, RITC)標記的CS和PCS制備二元、三元基因遞送系統(tǒng),CLSM觀察其細胞攝取、胞內(nèi)內(nèi)涵體逃逸和報告基因的細胞內(nèi)釋放過程。FC定量測定陽性細胞百分率和平均熒光強度,考察基因遞送系統(tǒng)在HEK293和EC-1細胞上的攝取能力,以γ-多聚谷氨酸(Poly(y-glutamic acid), γ-PGA)為攝取抑制劑,研究基因遞送系統(tǒng)在HEK293細胞上的入胞途徑。以HEK293為模型細胞,CLSM共定位分析,研究基因遞送系統(tǒng)的內(nèi)涵體逃逸和報告基因的釋放動力學；以巨噬細胞RAW264.7作為模型細胞,CLSM觀察基因遞送系統(tǒng)的細胞攝取,考察PEG修飾對基因遞送系統(tǒng)被網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)(Reticuloendothelial system, RES)吞噬的影響。經(jīng)EDC介導,得到兩親性CS嫁接物。核磁共振氫譜確證了CS和PCS的化學結構,二者的氨基取代度分別為7.1%和11.0%,其相應的臨界膠束濃度分別為72.0和89.0 pg/mL;濃度為10mg/mL時,其表面電位分別為18.7±0.6和16.3±1.6 mV。TEM圖顯示膠束呈類球形,粒徑較小,分布均一。嫁接物膠束具有較強的pDNA密接能力,當N/P比≥1時,CS完全阻滯pDNA遷移,CS/pDNA和PCS/pDNA二元、CS/PG/pDNA三元基因遞送系統(tǒng)均具備DNaseI酶保護能力。體外基因轉染結果顯示,在HEK293細胞上,當N/C/P比為2.5：1：1時,CS/PG/pDNA三元基因遞送系統(tǒng)達到最大基因轉染效率40.8%,為CS/pDNA和PCS/pDNA-二元基因遞送系統(tǒng)的30.4和50.0倍；在EC-1細胞上,當N/C/P比為10：1：1時,CS/PG/pDNA-Ⅲ三元基因遞送系統(tǒng)達到最大基因轉染效率11.6%,為CS/pDNA和PCS/pDNA二元基因遞送系統(tǒng)的1.9和3.7倍。以γ-PGA為抑制劑,攝取實驗結果表明,CS/PG/pDNA三元基因遞送系統(tǒng)經(jīng)由γ-PGA特異性受體介導的方式入胞；γ-P GA分子結構中的羧基質子化,促進了三元基因遞送系統(tǒng)的內(nèi)涵體逃逸；其的陰離子特性,通過松弛三元基因遞送系統(tǒng)的密接結構、調(diào)節(jié)電荷密度,從而促進pDNA從基因遞送系統(tǒng)中的釋放。PEG修飾,減少了RAW264.7細胞對CS/PG/pDNA三元基因遞送系統(tǒng)的攝取,表明PEG化可以降低RES對基因遞送系統(tǒng)的吞噬作用。
【關鍵詞】：殼聚糖-硬脂酸嫁接物 γ-多聚谷氨酸 聚乙二醇化 內(nèi)涵體逃逸 pDNA釋放 基因轉染
【學位授予單位】：浙江大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R943
【目錄】：

• 致謝4-5
• 中文摘要5-8
• Abstract8-11
• 縮寫清單11-16
• 引言16-18
• 1 糖脂嫁接物的合成及其理化性質研究18-30
• 1.1 試劑與儀器18-19
• 1.1.1 試劑18
• 1.1.2 儀器18-19
• 1.2 實驗方法19-21
• 1.2.1 殼聚糖-硬脂酸糖脂嫁接物的合成19
• 1.2.2 聚乙二醇化糖脂嫁接物的合成19
• 1.2.3 核磁共振分析19-20
• 1.2.4 氨基取代度測定20
• 1.2.5 臨界膠束濃度測定20-21
• 1.2.6 粒徑和表面電位測定21
• 1.2.7 透射電子顯微鏡觀察21
• 1.3 結果與討論21-27
• 1.3.1 糖脂嫁接物的合成及結構確證21-24
• 1.3.2 氨基取代度24-25
• 1.3.3 臨界膠束濃度25-26
• 1.3.4 粒徑與表面電位26-27
• 1.3.5 透射電子顯微鏡觀察27
• 1.4 小結27-30
• 2 糖脂嫁接物/聚乙二醇化多聚谷氨酸/pDNA三元基因遞送系統(tǒng)的基因轉染研究30-50
• 2.1 試劑與儀器30-31
• 2.1.1 試劑30-31
• 2.1.2 儀器31
• 2.2 實驗方法31-36
• 2.2.1 基因遞送系統(tǒng)的制備31-33
• 2.2.2 粒徑和表面電位測定33
• 2.2.3 透射電子顯微鏡觀察33
• 2.2.4 凝膠阻滯分析33
• 2.2.5 酶保護實驗33-34
• 2.2.6 細胞培養(yǎng)34
• 2.2.7 基因轉染34-35
• 2.2.7.1 HEK293細胞系轉染的熒光觀察34
• 2.2.7.2 HEK293細胞系轉染的定量研究34
• 2.2.7.3 EC-1細胞系轉染的熒光觀察34-35
• 2.2.7.4 EC-1細胞系轉染的定量研究35
• 2.2.8 細胞毒性35-36
• 2.2.8.1 基因載體與基因遞送系統(tǒng)的細胞毒性35
• 2.2.8.2 基因遞送系統(tǒng)的轉染毒性35-36
• 2.3 結果與討論36-49
• 2.3.1 粒徑和表面電位36-37
• 2.3.2 凝膠阻滯分析37-38
• 2.3.3 酶保護實驗38-39
• 2.3.4 透射電子顯微鏡觀察39-40
• 2.3.5 基因轉染40-47
• 2.3.5.1 HEK293細胞系轉染的熒光觀察及定量42-43
• 2.3.5.2 EC-1細胞系轉染的熒光觀察及定量研究43-47
• 2.3.6 胞毒性47-49
• 2.2.6.1 基因載體與基因遞送系統(tǒng)的細胞毒性47-49
• 2.3.6.2 基因遞送系統(tǒng)的轉染毒性49
• 2.4 小結49-50
• 3 糖脂嫁接物/聚乙二醇化多聚谷氨酸/pDNA三元基因遞送系統(tǒng)的基因轉染機制研究50-68
• 3.1 試劑與儀器50-51
• 3.1.1 試劑50-51
• 3.1.2 儀器51
• 3.2 實驗方法51-54
• 3.2.1 細胞培養(yǎng)51
• 3.2.2 基因遞送系統(tǒng)細胞攝取51-53
• 3.2.2.1 基因載體熒光標記51-52
• 3.2.2.2 基因遞送系統(tǒng)攝取的熒光觀察52
• 3.2.2.3 基因遞送系統(tǒng)定量攝取52
• 3.2.2.4 抑制性攝取實驗52-53
• 3.2.3 基因遞送系統(tǒng)的內(nèi)-溶酶體逃逸機制53
• 3.2.4 基因遞送系統(tǒng)的pDNA釋放動力學53-54
• 3.2.4.1 凝膠阻滯實驗53
• 3.2.4.2 pDNA體外釋放53-54
• 3.3 結果與討論54-66
• 3.3.1 基因遞送系統(tǒng)細胞攝取54-57
• 3.3.1.1 基因遞送系統(tǒng)攝取的熒光觀察54-56
• 3.3.1.2 定量攝取研究56-57
• 3.3.2 內(nèi)吞抑制劑對基因遞送系統(tǒng)攝取的影響57-58
• 3.3.3 基因遞送系統(tǒng)的巨噬細胞RAW264.7攝取58-61
• 3.3.4 基因遞送系統(tǒng)的內(nèi)-溶酶體逃逸機制61-62
• 3.3.5 pDNA釋放機制62-66
• 3.3.5.1 凝膠阻滯分析62-64
• 3.3.5.2 共聚焦顯微鏡觀察64-66
• 3.4 結論66-68
• 4 結論68-70
• 參考文獻70-76
• 綜述76-96
• 參考文獻90-96
• 作者簡歷96

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本文編號：266879