發(fā)布時(shí)間：2015-01-09 11:09

 

【摘要】 桑白皮(Cortex Mori)是�？粕僦参颩orus alba L的干燥根皮。為中國(guó)藥典收載的常用中藥之一,具有瀉肺平喘、利水消腫功效�，F(xiàn)代藥理研究表明,桑白皮降糖降脂主要藥效成分為桑白皮黃酮、生物堿及多糖類(lèi)成分。本課題選用桑白皮進(jìn)行研究,以期進(jìn)一步揭示桑白皮藥理作用物質(zhì)基礎(chǔ),為有效部位的研究和新制劑的開(kāi)發(fā)提供方法與依據(jù)。本文在綜述了桑白皮國(guó)內(nèi)外研究現(xiàn)狀的基礎(chǔ)上,進(jìn)行了桑白皮的質(zhì)量控制；桑白皮有效部位的提取純化工藝；桑白皮有效部位的質(zhì)控及初步藥效研究。1.桑白皮的含量測(cè)定研究采用紫外分光光度法和高效液相法,以桑根酮C、D、DNJ、葡萄糖為對(duì)照,測(cè)定提取物中總黃酮、總生物堿、總多糖、桑根酮C、D、DNJ的含量。2.桑白皮提取純化工藝的研究本研究?jī)?yōu)化了桑白皮黃酮、生物堿及多糖的同步提取工藝,通過(guò)單因素考察,確立了最佳的提取工藝。純化工藝在串聯(lián)的高壓大孔樹(shù)脂和離子交換樹(shù)脂的基礎(chǔ)上,采用同步提取、稀醇上樣及分別洗脫對(duì)桑白皮總黃酮、總生物堿及總多糖進(jìn)行精制純化。通過(guò)對(duì)各個(gè)影響因素的考察,得到最佳的純化工藝：將高壓PIPO-01大孔樹(shù)脂和001×7型陽(yáng)離子交換樹(shù)脂柱串聯(lián),原藥液經(jīng)濃縮后,上樣液濃度為0.12g/mL,上樣量(樹(shù)脂與上樣藥材量比值)為1倍量,8BV水洗脫后,分別用8BV80%乙醇洗脫大孔樹(shù)脂柱,6BV0.5moL/L氨水洗脫離子交換樹(shù)脂柱。收集70%乙醇部分,減壓濃縮至干,真空干燥,得到的各有效部位的純度在50.0%以上。3.桑白皮有效部位質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究經(jīng)過(guò)對(duì)桑白皮有效部位的提取、純化,初步建立了以桑根酮D、DNJ及葡萄糖為對(duì)照品的桑白皮有效部位TLC鑒別方法；并建立了桑白皮總黃酮、總生物堿及總多糖UV含量測(cè)定方法和桑根酮C、D、DNJ的HPLC法含量測(cè)定方法,初步建立有效部位的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。4.桑白皮藥材不同部位降血糖初步研究采用高脂飼料和STZ誘導(dǎo)小鼠形成2型糖尿病模型的方法,對(duì)桑白皮不同部位的降糖藥理作用進(jìn)行了初步探討,結(jié)果表明有效部位具有一定的降血糖作用。 

引 言

桑白皮（Cortex Mori)是�？粕僦参颩orus alba L.的干燥根皮。性甘微苦、寒，歸肺經(jīng)，具有灣肺平喘、利水消腫功能，主治肺熱喘咳、水腫脹滿尿少、面目肌膚浮腫。民間常用于消炎、利尿、解熱、鎮(zhèn)咳、怯痰等。始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，列為中品，歷代本草均有收載。《本草綱目》載：桑白皮主治消渴尿多；南北朝劉宋《雷公炮灸論》認(rèn)為桑白皮在中藥中有獨(dú)特效用，“是它藥不替也”�，F(xiàn)代研究表明桑白皮中含有黃酮、生物堿、多糖、香豆素、糖蛋白、揮發(fā)油等。藥理研宄表明桑白皮具有降血糖、降血壓、抗腫瘤、抗炎抑菌、抗病毒等作用。

迄今為止，國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道的多是桑白皮化學(xué)成分的提取分離，或提取物、化學(xué)成分的藥理研究，制劑及其臨床應(yīng)用方面不多，質(zhì)量控制方面的研宄較少，2010年版藥典中規(guī)定了桑白皮的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，但僅收載了一項(xiàng)薄層鑒別，沒(méi)有含量測(cè)定項(xiàng)。對(duì)于桑白皮提取物，目前仍未有文獻(xiàn)來(lái)規(guī)定其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。所以需要制定一個(gè)比較完善的桑白皮提取物的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。
中草藥化學(xué)成分提取分離技術(shù)發(fā)展日新月異，中藥有效部位和有效單體的開(kāi)發(fā)也越來(lái)越受重視。而中藥提取分離制備方法的研究，為進(jìn)一步探討中藥質(zhì)量、提高制劑生產(chǎn)、中藥的治病機(jī)制水平、提高臨床療效提供了前提，也是實(shí)現(xiàn)中藥現(xiàn)代化的關(guān)鍵。前人研究較多的是桑白皮中生物堿類(lèi)成分，特別是DNJ分離純化以及其對(duì)a -糖苷酶抑制作用的研宄，對(duì)桑白皮中異戊煉基黃酮及多糖成分研究較少。本研宄旨在建立一種簡(jiǎn)便、經(jīng)濟(jì)的方法同時(shí)提取分離得到桑白皮的多種活性成分。
采用大孔吸附樹(shù)脂從中藥及其復(fù)方中有選擇性地吸附其中的有效部分，去除無(wú)效部分的提取精制分離技術(shù)己較廣泛地應(yīng)用于天然產(chǎn)物的分離，特別是用于黃酮類(lèi)物質(zhì)的提取分離。通過(guò)陽(yáng)離子交換樹(shù)脂離子交換作用，與提取液中生物堿陽(yáng)離子發(fā)生交換吸附，富集純化桑白皮中含量較低的生物堿類(lèi)成分，同時(shí)將其與多糖類(lèi)成分有效的分離幵來(lái)。本文釆用高壓柱將兩種樹(shù)脂柱串聯(lián)，實(shí)現(xiàn)了較常壓柱子更快捷、方便的連續(xù)分離的方法，提取后的濃縮液依次經(jīng)過(guò)大孔樹(shù)脂和陽(yáng)離子樹(shù)脂，可以同時(shí)分離得到黃酮類(lèi)、多糖類(lèi)和生物堿類(lèi)組份。
.........................................

第一章研究概況

第一節(jié)桑白皮研究概況
桑白皮(^Cortex Mori)是�？粕僦参颩orus alba L的干燥根皮。始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，列為中品，歷代本草均有收載。桑白皮性甘微苦、寒，歸肺經(jīng)，具有灣肺平喘、利水消腫功能，主治肺熱喘咳、水腫脹滿尿少、面目肌膚浮腫[']。民間常用于消炎、利尿、解熱、鎮(zhèn)咳、祛痰等。
1.1桑白皮化學(xué)成分
曰本學(xué)者Nomura T.在20世紀(jì)80年代初領(lǐng)導(dǎo)的研宄小組對(duì)桑白皮alba L )化學(xué)成分進(jìn)行了系統(tǒng)的研宄，從中發(fā)現(xiàn)了許多結(jié)構(gòu)新穎的Diels-Alder型加合物。迄今為止，國(guó)內(nèi)外研究人員已經(jīng)從桑屬植物中得到百余種新化合物，主要包括異戊稀基黃酮類(lèi)化合物、Diels-Alder型加合物、多經(jīng)基生物堿和苗類(lèi)化合物等。另外，還含有多糖、三蔽、留體、氨基酸和香豆素等化合物。
1.1.1異戊稀基黃酮類(lèi)成分
異戊稀基黃酮化合物是一大類(lèi)分布于桑科、豆科和菊科等少數(shù)幾個(gè)科的植物中的天然產(chǎn)物，具有非常明顯的化學(xué)分類(lèi)學(xué)特征。它們以多方面的生理活性及獨(dú)特的化學(xué)結(jié)構(gòu)引起了國(guó)內(nèi)外藥學(xué)家的廣泛興趣，異戊稀基黃酮化合物被認(rèn)為是作為植物防衛(wèi)素，在植物抵御外來(lái)生物的侵襲過(guò)程中，它會(huì)發(fā)揮重要的植物生理調(diào)節(jié)作用。
研究表明，異戊稀基黃酮類(lèi)化合物具有多種生物活性，例如，降血壓、抗真菌、抗病菌、抗氧化、抗HIV、抗腫瘤等[2”"；黃酮類(lèi)化合物至少要求有酸經(jīng)基和一定的親脂性才認(rèn)為有生物活性(尤其是抗微生物的活性)的，學(xué)術(shù)界普遍這樣認(rèn)為。據(jù)NikaidoT.等報(bào)道，異戊稀基的存在，使得黃酮類(lèi)化合物中親脂性極大的增長(zhǎng)，強(qiáng)烈的親和生物膜性，進(jìn)而使得相關(guān)生物活性顯著提高["]。由于異戊稀基黃酮類(lèi)化合物在藥理研宄中表現(xiàn)出多種明顯的活性，從20世紀(jì)70年代開(kāi)始，對(duì)該類(lèi)成分的研究也愈來(lái)愈引起人們的關(guān)注。迄今為止，天然由來(lái)的該類(lèi)化合物已有上千余種。
.......................................

第二節(jié)2型糖尿病研究概況
2.1糖尿病簡(jiǎn)介
糖尿�。―iabetes mellitus)通常是指2型糖尿�。═ype 2 Diabetes mellitus)。糖尿病可分為1型和2型。1型糖尿病是指：病人胰島B細(xì)胞破壞，引起胰島素絕對(duì)缺乏，有酮癥酸中毒傾向的糖尿病。2型糖尿病是指：以胰島素抵抗為主伴胰島素分泌不足，或胰島素分泌不足為主伴或不伴胰島素抵抗的糖尿病。通常所說(shuō)的糖尿病通常指2型糖尿病，占DM總數(shù)的90%以上[_]。一般意義上認(rèn)為糖尿病表現(xiàn)為“三多一少”癥狀，即多飲、多食、多尿、體重減少。但是，II型糖尿病有90%是肥胖者，糖尿病患病率與肥胖的流行、靜態(tài)生活方式有關(guān)，而且與年齡增加呈正相關(guān)
。
糖尿病除了自身糖代謝紊亂所帶了的危害外，其長(zhǎng)期的高血糖還可累及各組織器官而引起一系列大血管及微血管并發(fā)癥（如心腦血管疾病、腎病變、神經(jīng)病變等）_，其對(duì)人體的危害遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)了糖尿病本身，在糖尿病患者中，70%的住院費(fèi)用是用于糖尿病慢性并發(fā)癥的治療，所以糖尿病又被稱(chēng)為“百病之源”。在這其中，糖尿病所帶來(lái)的最直接的危害體現(xiàn)在其對(duì)心臟病變的影響。糖尿病心臟病變（DiabeticCardiopathy)臨床指糖尿病并發(fā)或伴發(fā)的心臟病，包括動(dòng)脈粥樣硬化心臟病、糖尿病性心肌病及糖尿病自主神經(jīng)病變_。心臟病變被稱(chēng)為是糖尿病最嚴(yán)重而突出的問(wèn)題，約占糖尿病患者死亡原因的80%，其中70%死于糖尿病性冠心病。2004年美國(guó)國(guó)家膽固醇教育規(guī)劃發(fā)表的第三個(gè)成人治療計(jì)劃（NCEP ATP III)提出，糖尿病患者10年內(nèi)發(fā)生冠脈事件的風(fēng)險(xiǎn)很高，并將糖尿病列為“冠心�。–HD)的等危癥” [95]。據(jù)世界衛(wèi)生組織相關(guān)研宄資料統(tǒng)計(jì)，1997年糖尿病患者約1.3億，預(yù)計(jì)到2025年全球糖尿病患者總數(shù)可能達(dá)到3億人。中國(guó)是目前糖尿病患者最多的國(guó)家之一，糖尿病患病率呈日益增長(zhǎng)趨勢(shì)。因此對(duì)2型糖尿病發(fā)病機(jī)制以及生物祀點(diǎn)的研宄是糖尿病治療的關(guān)鍵，并成為糖尿病領(lǐng)域的科研熱點(diǎn)及難題。
目前研宄認(rèn)為，胰島素抵抗和P細(xì)胞胰島素分泌缺陷是2型糖尿病發(fā)病的兩個(gè)主要環(huán)節(jié)。胰島素抵抗是2型糖尿病發(fā)病環(huán)節(jié)中的重要組成部分，其發(fā)生發(fā)展過(guò)程貫穿于2型糖尿病發(fā)生發(fā)展過(guò)程中，也是糖尿病早期和主要表現(xiàn)。
.....................................

第二章 桑白皮黃酮、生物堿及多糖測(cè)定方法研究 ...............21-34 
1.1 儀器與材料 ...........................21 
1.2 方法與結(jié)果 ...................21-32 
1.2.1 總黃酮含量測(cè)定................. 21-24 
1.2.2 桑根酮C、D含量測(cè)定................. 24-27 
1.2.3 總生物堿含量測(cè)定.............. 27-28 
1.2.4 1-脫氧野尻霉素(DNJ)含量測(cè)定 .............28-30 
1.2.5 總多糖含量測(cè)定 ......................30-32 
1.3 討論............................. 32-34 
第三章 桑白皮有效部位的同步高效提取純化工藝研究 ..................34-51 
第一節(jié) 桑白皮有效部位的同步高效提取工藝研究.............. 34-39 
1.1 儀器與材料 ............................34 
1.2 方法與結(jié)果 .................34-38 
1.3 討論 ......................38-39 
第二節(jié) 桑白皮有效部位的同步高效純化工藝研究 .................39-49 
2.1 儀器與材料 ...............................39-40 
2.2 方法與結(jié)果 ....................40-48 
2.3 .........................討論 48-49 
第三節(jié) 桑白皮有效部位的同步高效提取純化工藝中試放大研究...................... 49-51 
3.1 儀器與材料 ...........................49 
3.2 方法與結(jié)果 ...............49-50 
3.3 討論................................ 50-51 
第四章 桑白皮有效部位質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究 ...................51-68

第五章 桑白皮不同部位對(duì)2型糖尿病小鼠降糖藥理作用的研究

本實(shí)驗(yàn)以高脂詞料加鏈脲佐菌素（STZ)誘導(dǎo)C57小鼠模型，來(lái)探討桑白皮不同部位對(duì)高脂飼料加鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的2型糖尿病小鼠血糖、血脂、低密度脂蛋白、胰島素的影響，并對(duì)其降糖作用機(jī)制進(jìn)行初步探討。
1. 1試驗(yàn)材料
1.1. 1動(dòng)物
5周齡雄性C57BL/6N小鼠，體重（19±2) g，SPF級(jí)，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供，醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證號(hào)為SCXR (京）2012-0001。動(dòng)物飼養(yǎng)于廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF級(jí)動(dòng)物房，飼養(yǎng)溫度與濕度：20-25°C、40-70%。采用12h:12h晝夜間斷照明，筆耕文化傳播，動(dòng)物自由進(jìn)食、飲水。
1.1.2詞料
基礎(chǔ)飼料、高脂飼料均由廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。高脂飼料配方組成：酷蛋白26.17%，L-胱氨酸0.39%,麥芽糖糊精16. 35%，鹿糖9. 00%，纖維素6. 54%，豆油，3. 27%,豬油 32. 06%,礦物質(zhì) AIN-93 4. 58%,維生素 AIN-93 1. 31%,氯化膽堿 0. 33%，膽固醇1. 0%,膽鹽0. 15%,合格證號(hào)為SCXK(粵)2008-0002。
1.1. 3試劑
桑白皮不同部位，總黃酮、總生物堿及總多糖是將桑白皮經(jīng)60%醇提后，適當(dāng)濃縮，上串聯(lián)大孔樹(shù)脂及離子交換樹(shù)脂得到，（由本實(shí)驗(yàn)室提供）�？傸S酮含量為60% (以桑根酮C計(jì)）；總生物堿含量為50% (以1-脫氧野尻霉素DNJ計(jì)）；總多糖含量為50%(以葡萄糖計(jì)）。
STZ (Sigma,批號(hào)：040M1367), 二甲雙胍（AladdinChemistry，批號(hào)：23195)，肝素鈉（江蘇萬(wàn)邦生化醫(yī)藥股份有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字H32020612),葡萄糖氧化試劑盒；甘油三酷試劑盒；總膽固醇試劑盒；低密度脂蛋白試劑盒；總膽紅素；尿酸（上述試劑盒均有上海榮盛生物藥業(yè)有限公司，批號(hào)分別為：20120801; 20121002； 20120801;20120701； 20121201; 20121201)； 11 0 -類(lèi)固醇脫氧酶試劑盒（美國(guó)R & D，批號(hào)分別為：DRE68753; DRE84576)；梓檬酸、梓檬酸鈉均為分析純。
............................................

結(jié)語(yǔ)

本文通過(guò)查閱國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)，并詳細(xì)分析桑白皮的中醫(yī)藥理論闡述、藥學(xué)、藥理藥效及臨床等方面的內(nèi)容，進(jìn)行了一系列的藥學(xué)藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)研究。
1.1桑白皮含量測(cè)定方法旳建立
建立了桑白皮總黃酮、總生物堿及總多糖含量測(cè)定方法。其中桑白皮總黃酮含量測(cè)定方法中與常用總黃酮含量測(cè)定的兩種顯色方法進(jìn)行比較，并詳細(xì)考察鹽酸-鎂粉顯色法。不足之處是沒(méi)有對(duì)總生物堿和總多糖含量測(cè)定方法做更深入的考察。
釆用HPLC-UV方法，經(jīng)色譜條件優(yōu)化，實(shí)現(xiàn)了桑白皮藥效成分桑根酮C、D及DNJ含量測(cè)定，為控制桑白皮及含有桑白皮的中成藥的質(zhì)量提供方法和依據(jù)。
1.2桑白皮有效部位的同步高效提取純化工藝
以桑白皮中總黃酮、DNJ及總多糖的含量為指標(biāo)，采用單因素考察優(yōu)化了提取工藝。以大孔樹(shù)脂、離子交換樹(shù)脂富集、純化桑白皮中總黃酮、總生物堿及總多糖對(duì)上樣量、洗脫用醇濃度、氨水濃度和用量等進(jìn)行工藝考察�？疾焖霉に噮�(shù)經(jīng)重復(fù)，證明方法穩(wěn)定可行。
此工藝的創(chuàng)新之處是實(shí)現(xiàn)了桑白皮三個(gè)有效部位的同步高效提取，稀醇上樣解決了桑白皮異戊稀基黃酮上樣難的問(wèn)題，串聯(lián)樹(shù)脂柱分別洗脫得到三個(gè)有效部位。
1.3桑白皮有效部位的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的研究
桑白皮有效部位在2010年版中國(guó)藥典的基礎(chǔ)上，做了薄層定性鑒別和總黃酮、總生物堿及總多糖、桑根酮C、D及DNJ含量測(cè)定，測(cè)定方法重復(fù)性強(qiáng)，穩(wěn)定可行。為桑白皮有效部位的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制定提供方法和依據(jù)。不足之處是生物堿的薄層定性鑒別沒(méi)有找到合適的展開(kāi)系統(tǒng)及顯色劑。
1.4桑白皮不同部位的降血糖藥理作用的研究
本文中采用高脂飼料+STZ誘導(dǎo)的2型糖尿病C57小鼠模型，對(duì)桑白皮不同部位的降血糖作用進(jìn)行了初步探討，結(jié)果表明桑白皮3個(gè)部位對(duì)2型糖尿病小鼠血糖均有一定的控制作用，其中異戊稀基黃酮類(lèi)及生物堿成分降糖降脂作用效果較為明顯，異戊稀基黃酮類(lèi)成分對(duì)于高脂飼料誘導(dǎo)的高血脂小鼠體重有明顯抑制作用，而且黃酮類(lèi)成分能夠降低低密度脂蛋白作用。進(jìn)一步對(duì)桑白皮不同部位降糖作用機(jī)制做了初步探討發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果不能證明桑白皮不同部位降糖作用是通過(guò)抑制肺中11 e-HSDl的水平，有待于進(jìn)一步的研究。
............................................
參考文獻(xiàn)：

[1] 陳君,韋建華,李兵,蔡少芳,張明站.  UV測(cè)定廣西不同產(chǎn)地倒地鈴中總黃酮的含量[J]. 中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志. 2012(13)
[2] 李平平,廖森泰,劉吉平,鄒宇曉.  桑中1-脫氧野尻霉素及其衍生物的研究進(jìn)展[J]. 中草藥. 2010(11)
[3] 夏志琳,石鶴峰.  糖尿病的中醫(yī)病機(jī)研究進(jìn)展[J]. 中醫(yī)研究. 2010(10)
[4] 張進(jìn)祥,段吉平.  紫外分光光度法測(cè)定金蓮花中總黃酮的含量[J]. 中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志. 2009(10)
[5] 覃國(guó)珍,戚璟瑩.  2型糖尿病患者肺功能改變及其臨床意義[J]. 廣西醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào). 2009(05)
[6] 鄒時(shí)禎.  2型糖尿病的中醫(yī)核心病機(jī)探析[J]. 亞太傳統(tǒng)醫(yī)藥. 2009(05)
[7] 武忠,陳粉蘭.  中藥治療糖尿病組方的中西結(jié)合思路和方法[J]. 中國(guó)民族民間醫(yī)藥. 2009(08)
[8] 劉學(xué),王鎂.  消渴病的病機(jī)與五臟關(guān)系探析[J]. 現(xiàn)代中西醫(yī)結(jié)合雜志. 2009(07)
[9] 李賽美,李易崇,李偉華,王志高.  糖尿病心臟病證候特征及演變規(guī)律探討[J]. 中華中醫(yī)藥雜志. 2007(08)
[10] 鄒麗宜,陳忻,吳鐵,許碧連,劉鈺瑜,張新樂(lè).  桑白皮低聚殼聚糖體內(nèi)抗腫瘤作用研究[J]. 現(xiàn)代中西醫(yī)結(jié)合雜志. 2007(01)

 

本文編號(hào)：11045