發(fā)布時間：2015-01-09 14:56

 

【摘要】 目的潑尼松(Prednisone, Pred)和甲潑尼龍(Methylprednisolone, MP)是廣泛應(yīng)用于臨床的兩種糖皮質(zhì)激素類藥物,潑尼松本身沒有藥理活性,需經(jīng)肝臟11β-羥基類固醇脫氫酶1(11β-hy droxysteroid dehydrogenase1,11β-HSD1)轉(zhuǎn)化為有活性的潑尼松龍繼而發(fā)揮作用。臨床上對于轉(zhuǎn)氨酶升高的肝功受損的病人醫(yī)生通常會選擇有活性的甲潑尼龍而不選擇潑尼松。本課題以四氯化碳致肝損傷大鼠為研究對象,觀察肝損傷時潑尼松、潑尼松龍及甲潑尼龍藥代動力學參數(shù)是否發(fā)生變化,探討肝損傷對Pred、潑尼松龍、MP藥動學的影響,評價肝損傷時應(yīng)用潑尼松和甲潑尼龍是否需要調(diào)整劑量,為臨床上轉(zhuǎn)氨酶升高病人應(yīng)用潑尼松、潑尼松龍和甲潑尼龍時的有效性與安全性提供初步的動物試驗數(shù)據(jù)。方法1.肝損傷大鼠模型的建立肝損傷組大鼠腹腔注射40%CC14溶液,24h后取血測定血清谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、白蛋白(A1b)、γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶(γ-GT)、總膽紅素(TBIL),并對大鼠解剖取肝臟,HE染色行病理學檢查,驗證肝損傷模型是否成功。2.潑尼松及潑尼松龍在正常及肝損傷大鼠體內(nèi)的藥代動力學實驗取24只SD大鼠,雌雄各半,隨機分為4組,分別為潑尼松正常組(PS-C組)、潑尼松肝損傷組(PS-Ⅰ組)、潑尼松龍正常組(PL-C組)和潑尼松龍肝損傷組(PL-Ⅰ組),每組6只,雌雄各半。按照“肝損傷大鼠模型的建立”項下方法建立肝損傷模型,24h后各正常組和肝損傷組分別灌胃給予潑尼松或潑尼松龍混懸液(15mg·kg-1),于給藥后10min、20min、30min、45min、1h、1.5h、2h、3h、4h、6h、8h取血。采用高效液相色譜法(HPLC)分析測定潑尼松龍的血藥濃度。3.甲潑尼龍在正常及肝損傷大鼠體內(nèi)的藥代動力學實驗取12只SD大鼠,雌雄各半,隨機分為2組,分別為甲潑尼龍正常組(MP-C組)和甲潑尼龍肝損傷組(MP-Ⅰ組),每組6只,雌雄各半。按照“肝損傷大鼠模型的建立”項下的方法建立肝損傷模型,24h后正常組及肝損傷組灌胃給予甲潑尼龍混懸液(25mg·kg-1),于給藥后15min30min、45min、1h1.5h、2h、3h、4h、6h、8h、10h取血。采用高效液相色譜法(HPLC)分析測定甲潑尼龍的血藥濃度。4.數(shù)據(jù)統(tǒng)計及分析對大鼠注射CCl4前后各生化指標進行雙側(cè)t檢驗；采用DAS ver2.0(Drug and Statistics for Windows)程序軟件計算藥動學參數(shù),對各組主要藥動學參數(shù)AUC0-t, AUC0-∞、MRT0-t, MRT0-∞、t1/2、Cmax、CL和V進行雙側(cè)t驗。結(jié)果1.肝損傷模型的建立大鼠注射四氯化碳24h后,AST、ALT和TBIL明顯升高(P<0.05), Alb.y-GT不變(P>0.05)；病理學檢查可見肝損傷大鼠肝組織肝小葉結(jié)構(gòu)保留,局部排列紊亂,中央靜脈周圍組織輕度水腫,肝細胞索排列尚整齊,肝血竇未見明顯充血,切片內(nèi)未見明確門管區(qū)。2.潑尼松龍及甲潑尼龍體內(nèi)測定方法的方法學考察本實驗所建立的潑尼松龍和甲潑尼龍的HPLC測定方法,樣品及內(nèi)標峰形良好,血漿中雜質(zhì)峰不干擾樣品的測定；潑尼松龍40.01027～5.125μg·mL-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好,甲潑尼龍在0.03109～1.4805μg·mL-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好；精密度、準確度、回收率、穩(wěn)定性等均符合藥動學研究相關(guān)測定要求。3.潑尼松藥動學參數(shù)及其統(tǒng)計學檢驗結(jié)果對肝損傷組與正常對照組進行雙側(cè)t檢驗,潑尼松肝損傷組與正常組(Prednisone-Injury group VS Prednisone-Control group, PS-I組VS PS-C組)相比,潑尼松活性潑尼松龍的各藥動學參數(shù)均無顯著性差異(P>0.05)；肝損傷影響亞組分析：將肝損傷組雄性與正常組雄性(PS-I-♂VS PS-C-(?))大鼠相比,肝損傷組雄性大鼠的潑尼松龍的清除率CL顯著下降(26.18±6.182VS40.06±4.736L-h-kg-1, P<0.05),其余各藥動學參數(shù)均無統(tǒng)計學差異(P>0.05)；將肝損傷組雌性與正常組雌性(PS-I-♀VS Ps-C-♀)大鼠相比,各藥動學參數(shù)均無統(tǒng)計學差異(P>0.05)；性別影響分析：將正常組內(nèi)雄性與正常組內(nèi)雌性(PS-C-♂VS PS-C-♀)大鼠比較,正常組內(nèi)雄性大鼠的藥動學參數(shù)CL、V顯著增大(P<0.05),AUCo. t.AUC0-∞、Cmax顯著減小(P<0.05),MRT0-∞、t1/2顯著縮短(P<0.05)；將損傷組內(nèi)雄性與損傷組內(nèi)雌性(PS-I-♂VS PS-I-♀)大鼠比較,損傷組內(nèi)雄性大鼠的藥動學參數(shù)CL、V顯著增大(P<0.05),AUC0-t.AUC0-∞、Cmax顯著減小(P<0.05),MRT0-∞、t1/2顯著縮短(P<0.05),MRT0-t、Tmax無統(tǒng)計學差異。4.潑尼松龍藥動學參數(shù)及其統(tǒng)計學檢驗結(jié)果潑尼松龍肝損傷組與正常組(Prednisolone-Injury group VS Prednisolone-Control group,PL-I組VS PL-C組)比較,各藥代動力學參數(shù)均無顯著性差異；肝損傷影響亞族分析：將潑尼松龍肝損傷組雄性與正常組雄性(PL-I-♂VS PL-C-♂),潑尼松龍肝損傷組雌性與正常組雌性(PL-I-♀VS PL-C-♀)大鼠相比,各藥動學參數(shù)均無顯著性差異(P>0.05)；性別影響分析：將正常組內(nèi)雄性與正常組內(nèi)雌性(PL-C-♂VS PL-C-♀性)大鼠比較,各藥動學參數(shù)無顯著性差異(P>0.05),將肝損傷組內(nèi)雄性與肝損傷組內(nèi)雌性(PL-I-♂VS PL-I-♀)大鼠比較,肝損傷組內(nèi)雄性大鼠的藥動學參數(shù)CL明顯增加(P<0.05),AUC0-∞顯著減小(P<0.05),MRT0-t,MRT0-∞、t1/2均顯著縮短(P<0.05),其余參數(shù)均無顯著性差異(P>0.05)。5.甲潑尼龍藥動學參數(shù)及其統(tǒng)計學檢驗結(jié)果甲潑尼龍肝損傷組與正常組(MP-Injury group VS MP-Control group,MP-I組VS MP-C組)比較,各藥代動力學參數(shù)均無顯著性差異；肝損傷影響亞族分析：將甲潑尼龍肝損傷組雄性與正常組雄性(MP-I-♂VS MP-C-♂)比較,各藥動學參數(shù)均無統(tǒng)計學差異(P>0.05)；甲潑尼龍肝損傷組雌性與正常組雌性(MP-I-♀VS MP-C-♀)比較,各藥動學參數(shù)均無統(tǒng)計學差異(P>0.05)；性別影響分析：將正常組內(nèi)雄性與正常組內(nèi)雌性(MP-C-♂VS MP-C-♀)大鼠比較,正常組內(nèi)雄性大鼠的CL、V明顯增加(P<0.05),AUC0-∞明顯減小(P<0.05),其余藥動學參數(shù)均無統(tǒng)計學差異(P>0.05)；將肝損傷組內(nèi)雄性與肝損傷組內(nèi)雌性(MP-I-♂VS MP-I-♀)大鼠相比,肝損傷組內(nèi)雄性大鼠的Cmax明顯減小(P<0.05),其余藥動學參數(shù)均無顯著性差異(P>0.05)。結(jié)論1.本實驗建立的CCl4誘導的急性肝損傷大鼠模型穩(wěn)定,該模型可用于肝損傷對藥物代謝影響的研究；2.本實驗建立的潑尼松龍和甲潑尼龍體內(nèi)測定方法專屬性強、穩(wěn)定性好、回收率高,適合潑尼松龍和甲潑尼龍體內(nèi)血藥濃度的測定；3.肝損傷可影響潑尼松在雄性大鼠體內(nèi)的代謝,使?jié)娔崴傻幕钚源x產(chǎn)物潑尼松龍的清除率下降,而對于雌性大鼠,肝損傷時其藥動學參數(shù)未出現(xiàn)顯著性改變；肝損傷時潑尼松龍和甲潑尼龍在大鼠體內(nèi)的藥動學參數(shù)未出現(xiàn)顯著性改變；另外潑尼松、潑尼松龍和甲潑尼龍三種藥物在大鼠體內(nèi)藥物代謝動力學存在性別差異。 

前言

糖皮質(zhì)激素在臨床上的應(yīng)用已有60余年歷史了，主要用于抗炎、免疫抑制、抗毒和抗休克，涉及多個臨床科室⑴。糖皮質(zhì)激素屬于留體類化合物，為類固醇激素。內(nèi)源性糖皮質(zhì)激素是由腎上腺皮質(zhì)分泌的，包括氫化可的松和可的松，糖皮質(zhì)激素類藥物根據(jù)作用時間可分為短效藥物（作用8?12h，包括氧化可的松、可的松）；中效藥物（作用12~36h，包括強的松（撥尼松）強的松龍（撥尼松龍）、甲強龍（甲撥尼龍）等）；長效藥物（作用36~54h，包括地塞米松、倍他米松等）。糖皮質(zhì)激素類藥物在臨床廣泛使用，在臨床上具有很重要的地位，同時糖皮質(zhì)激素藥物也具有較多的不良反應(yīng)[2]，對糖、脂肪和蛋白質(zhì)的代謝都有影響；另外糖皮質(zhì)激素也具有一定的鹽皮質(zhì)激素樣作用，可影響電解質(zhì)的代謝，使電解質(zhì)代謝紊亂；此外糖皮質(zhì)激素可以減少韓的吸收，促進骨韓分解，其典型的不良反應(yīng)為骨質(zhì)疏松；除此以外，使用糖皮質(zhì)激素會對腎上腺功能產(chǎn)生抑制作用，大劑量長期使用不能驟然停藥，否則會出現(xiàn)反跳現(xiàn)象。
潑尼松和甲撥尼龍是臨床上常用的兩種糖皮質(zhì)激素類藥物，口服生物利用度良好，約為60%~90%，主要在肝臟代謝，經(jīng)腎臟排泄，但它們在藥代動力學方面表現(xiàn)出較大的差異[3]。撥尼松沒有藥理活性，在體內(nèi)撥尼松11位酮基經(jīng)lip-經(jīng)基類固醇脫氫酶 1 (lip-hydroxysteroid dehydrogenase 1，llp-HSDl)還原為經(jīng)基（即撥尼松龍）后繼而發(fā)揮藥理活性[4]。撥尼松和撥尼松龍在體內(nèi)的藥動學過程是一種具有可逆代謝和非線性消除的復雜過程[5]。1 ip-經(jīng)基類固醇脫氫酶在C-11位的氧化還原反應(yīng)使撥尼松和撥尼松龍相互轉(zhuǎn)化，而在體內(nèi)代謝過程中，撥尼松向撥尼松龍的轉(zhuǎn)化比較快，而撥尼松龍轉(zhuǎn)化為撥尼松的速度比較慢[6]，因此血梁中撥尼松龍濃度要高于撥尼松[7]。在體內(nèi)血裝中的皮質(zhì)激素球蛋白（CBG)濃度較白蛋白濃度高，但是撥尼松龍與CBG的親和力要高于與白蛋白的親和力，因此在體內(nèi)撥尼松龍大部分與CBG特異性結(jié)合[8，9]，少部分與白蛋白結(jié)合。另外撥尼松龍與CBG的結(jié)合力為撥尼松的10倍[10]。撥尼松龍在治療范圍內(nèi)與血菜蛋白的結(jié)合呈非線性[11]，其藥動學呈高度劑量相關(guān)性[12]，表觀分布容積(V)和清除率(CL)呈顯著劑量依賴性，且隨著CL和V下降，血藥濃度升高，兩種效應(yīng)形成互補作用導致半衰期ti/2不變。甲撥尼龍與撥尼松龍僅相差6a位甲基，與撥尼松龍不同，甲撥尼龍不與CBG結(jié)合，僅與白蛋白結(jié)合，并且甲撥尼龍與血裝蛋白的結(jié)合呈線性，在16?1000 mg劑量范圍內(nèi)藥動學均呈非劑量依賴性。甲撥尼龍大劑量靜脈注射時藥動學過程呈二室模型，口服及小劑量靜脈給藥時其藥動學過程呈一室模型[I3]。
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第一部分肝損傷大鼠模型的建立

本實驗通過對大鼠腹腔注射CC14，建立肝損傷大鼠模型，通過測定腹腔注射CC14前后血清中谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT)、白蛋白(Alb)、y-GT和總膽紅素，并分別取正常和肝損傷大鼠進行解剖，取肝組織觀察并行HE染色，觀察病理學變化，以驗證肝損傷模型是否成功。
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1實驗材料
1.1主要儀器
Biofuge Stratos全能臺式高速冷凍離心機美國Thermo Fisher公司
Spectra Max 190 酶標儀 美國 Molecular Devices 公司
紫外分光光度計（930-UVIKON) 美國KONTRON公司
1.2主要試劑
肝素鈉注射液 上海信誼藥廠有限公司，批號11111
CCU 國藥集團化學試劑有限，批號20130120
玉米油 市售玉米油
谷丙轉(zhuǎn)氨酶測定試劑盒南京建成生物工程研究所，批號20130306，20130907
谷草轉(zhuǎn)氨酶測定試劑盒南京建成生物工程研究所，批號20130328，20130927
白蛋白測定試劑盒 南京建成生物工程研究所，批號20130319，20130918Y-GT測定試劑盒 南京建成生物工程研究所，批號20121209，20130910
總膽紅素測定試劑盒 南京建成生物工程研究所，批號20130330，20130929
13實驗動物
SPF級別SD大鼠，體質(zhì)量250-280g，筆耕文化傳播，雌雄各半，由北京華阜康生物科技股份有限公司提供，動物合格證號SCXK (京）2009-0004。
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第二部分 潑尼松及潑尼松龍在肝損傷大鼠體內(nèi)的藥動學研究............ 33-55 
1 實驗材料............................. 33-34 
1.1 主要儀器............................ 33 
1.2 主要試劑 ..................33-34 
1.3 實驗動物............... 34 
2 實驗方法................... 34-42 
2.1 潑尼松龍體內(nèi)測定方法的建立........................... 34-41 
2.1.1 潑尼松龍與內(nèi)標(卡馬西平)對照品溶液的配制 ...............34-35 
2.1.2 色譜條件...................................... 35 
2.1.3 血漿樣品的處理 ....................35 
2.1.4 方法的專屬性.................... 35-36 
2.1.5 標準曲線的建立............... 36-37 
2.1.6 定量下限的測定................... 37 
2.1.7 精密度試驗 .........................37-38 
2.1.8 回收率實驗..................... 38-40 
2.1.9 血漿樣本穩(wěn)定性考察 ........................40-41 
2.2 藥動學實驗........................... 41-42 
2.2.1 實驗方案 ........................41-42 
2.2.2 藥動學參數(shù)計算及統(tǒng)計分析..................... 42 
3 結(jié)果 ...............................42-49 
3.1 HPLC方法學驗證......................... 42 
3.2 潑尼松龍血藥濃度-時間曲線 .....................42-43 
3.3 藥代動力學參數(shù)及統(tǒng)計結(jié)果.................. 43-49 
3.3.1 給予潑尼松的結(jié)果 ......................................43-46 
3.3.2 給予潑尼松龍的結(jié)果 ................46-49 
4 討論 ...................................49-54 
4.1 實驗動物性別的選擇.................... 49 
4.2 給藥時間的選擇................ 49-50 
4.3 測定指標的選擇............................... 50 
4.4 HPLC方法的建立.................... 50-51 
4.5 肝損傷對藥動學參數(shù)的影響 .....................51-52 
4.6 潑尼松及潑尼松龍代謝的性別差異 ...............52-54 
4.7 實驗局限性 ...............................54 
5 結(jié)論.............................. 54-55 

第三部分 甲潑尼龍在肝損傷大鼠體內(nèi)的藥動學研究

本實驗通過建立高效液相色譜法（HPLC)測定大鼠血獎中的甲撥尼龍，研究甲撥尼龍在肝損傷模型大鼠體內(nèi)旳藥代動力學與正常對照組相比是否發(fā)生變化，用以推測肝損傷時使用甲撥尼龍是否需要調(diào)整給藥方案，為臨床上肝功能受損的病人應(yīng)用甲撥尼龍時的有效性與安全性提供初步的動物試驗數(shù)據(jù)。
1實驗材料
1.1主要儀器
Biofiige Stratos全能臺式高速冷凍離心機美國Thermo Fisher公司
930-UVIKON紫外分光光度計 美國KONTRON公司
HHW-420恒溫水浴箱 金壇市雙捷實驗儀器廠
Waters 515型高效液相色譜儀 美國Waters公司
MODEL 500型Lab Alliance檢測器 美國SSI公司
CPA225D型電子天平 德國Sartorius公司
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結(jié)論

本文釆用ccu誘導形成肝損傷大鼠模型，系統(tǒng)地對肝損傷時撥尼松、撥尼松龍和甲撥尼龍三種藥物進行藥代動力學研究，通過與正常大鼠比較，觀察肝損傷對撥尼松、撥尼松龍和甲撥尼龍藥代動力學的影響，探討肝損傷時對于撥尼松、撥尼松龍和甲撥尼龍三種藥物的臨床選擇，以期為潑尼松、撥尼松龍和甲撥尼龍在臨床上的合理應(yīng)用提供初步的動物實驗數(shù)據(jù)，提高臨床用藥的有效性和安全性。
全文所得結(jié)論如下：
1.本實驗建立的ccu誘導的急性肝損傷大鼠模型穩(wěn)定，該模型可用于肝損傷對藥物代謝影響的研究；
2.本實驗建立的撥尼松龍和甲撥尼龍體內(nèi)測定方法專屬性強、穩(wěn)定性好、回收率高，適合撥尼松龍和甲撥尼龍體內(nèi)血藥濃度的測定；
3.肝損傷可影響撥尼松在雄性大鼠體內(nèi)的代謝，使撥尼松的活性代謝產(chǎn)物撥尼松龍的清除率下降，而對于雌性大鼠，肝損傷時其藥動學參數(shù)未出現(xiàn)顯著性改變；肝損傷時撥尼松龍和甲潑尼龍在大鼠體內(nèi)的藥動學參數(shù)未出現(xiàn)顯著性改變；另外撥尼松、撥尼松龍和甲撥尼龍三種藥物在大鼠體內(nèi)藥物代謝動力學存在性別差異。
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參考文獻:

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本文編號：11074