【摘要】 金屬植入體涂層除了要求具有高生物學(xué)響應(yīng)性外,還需具有良好的藥物/生長因子的承載和釋放能力,以期有優(yōu)良的生物學(xué)環(huán)境,促進(jìn)骨形成,從而加快骨整合過程。高生物學(xué)響應(yīng)涂層由于其厚度薄且多孔,會限制藥物的承載和產(chǎn)生快速的釋放。在本研究中,我們基于礦化膠原薄層具有高生物學(xué)響應(yīng)的特征,利用殼聚糖與藥物良好結(jié)合力的特點(diǎn),開展了將殼聚糖微球組裝入多孔薄層提高藥物承載能力和改善釋放行為的研究,進(jìn)行了生物學(xué)評價。主要獲得的實驗結(jié)果總結(jié)如下：殼聚糖微球組裝增強(qiáng)抗菌藥物承載和釋放能力的研究：通過電化學(xué)沉積技術(shù)在鈦基板上形成礦化膠原-殼聚糖微球涂層,殼聚糖微球可緊密地粘附在礦化程度較弱的膠原纖維上。由于殼聚糖微球與抗菌藥物鹽酸萬古霉素(VH)有良好的結(jié)合力,1h的釋放量從65%降低到了37.2%,涂層的爆發(fā)性釋放得到了有效抑制。在96h后,涂層依仍有藥物釋放,說明具有較好的緩釋性�？咕鷮嶒炓沧C明含VH的礦化膠原-殼聚糖微球涂層在短期和較長期有良好的抗菌效能。殼聚糖微球組裝增強(qiáng)生物因子(BMP-2)承載和釋放能力的研究：通過電泳注入法,將負(fù)載有生長因子rhBMP-2的殼聚糖微球注入到多孔礦化膠原涂層中,其微球存在于礦化膠原涂層的孔壁上。由于殼聚糖微球作用,rhBMP-2的承載量從446ng/cm2提高到了1186ng/cm2,提高了1.7倍。rhBMP-2在涂層中的釋放期可達(dá)30天以上,顯示出良好的緩釋特性。由于rhBMP-2承載量有效的提高,體外細(xì)胞實驗表明前成骨細(xì)胞的分化和礦化過程都得到有效地加速,動物體內(nèi)實驗表明8周拔出強(qiáng)度提高了30.16%,并且骨整合過程已基本完成。因此,殼聚糖微球在不影響礦化膠原涂層高生物學(xué)響應(yīng)性的基礎(chǔ)上可以顯著改善其承載和釋放的能力,使得礦化膠原涂層獲得優(yōu)良的抗菌和促進(jìn)骨整合的效果。 

第一章緒論

1.1引言
在當(dāng)代社會中，由于各種原因引起的骨科疾病如各種骨折、骨缺損、感染等困擾著人們，在治療各種骨科疾病的過程中，硬骨替代材料的應(yīng)用越來越廣泛。據(jù)統(tǒng)計，僅在美國，2009年的硬骨替代材料的銷售額為15億美元，并且以每年15%的速度快速增長，而在我國，由于老齡化的加速，骨缺損、骨質(zhì)疏松等疾病就更加常見，其潛在的市場價值非常巨大。
人工硬骨替代材料主要有金屬材料、無機(jī)材料和高分子材料等。這些生物醫(yī)用材料均具有各自的優(yōu)勢，但因各自的缺點(diǎn)在應(yīng)用時都受到了一定的限制。隨著骨組織工程的不斷發(fā)展，人們對人工骨替代材料的要求越來越高。一般在理想情況下，用于承力的人工骨替代材料應(yīng)具備以下要求：一定的機(jī)械強(qiáng)度，能承受并傳遞負(fù)載；優(yōu)良的生物活性和生物相容性；良好的骨引導(dǎo)活性即骨誘導(dǎo)性和骨傳導(dǎo)性；植入手術(shù)后無感染、炎癥或其他并發(fā)癥產(chǎn)生等。
硬骨替代材料經(jīng)常被用作固定或替代骨折后長久不能愈合的長骨、調(diào)整和穩(wěn)定骨折或者畸形的脊柱以及關(guān)節(jié)置換等。這些骨器械的首要目的是在病變或缺損的骨組織在受力時提供物理穩(wěn)定性。通過此種方法，植入體可以幫助減輕病變或缺損部位的病痛，并盡早恢復(fù)其功能性⑴。
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1.2醫(yī)用鈥及鈥合金植入體的表面改性
1.2.1醫(yī)用鈥及鈥合金
由于創(chuàng)傷、腫瘤切除、感染、骨質(zhì)疏松等病例越來越多的出現(xiàn)，尋找合適的修復(fù)材料，成為生物材料研究的熱點(diǎn)之一。在進(jìn)行硬組織（如骨路、關(guān)節(jié)、牙齒）修復(fù)時，要求替代材料能承受或傳遞負(fù)載。醫(yī)用金屬材料由于具有高機(jī)械強(qiáng)度和抗疲勞性能而成為臨床應(yīng)用最廣泛的植入材料，在骨支撐修復(fù)手術(shù)中起到無可替代的作用[2]，已經(jīng)用于臨床的醫(yī)用金屬材料主要有醫(yī)用不銹鋼、鉆基合金、鈥及鈥基合金等。
第二次世界大戰(zhàn)后，由于航天與軍事工業(yè)發(fā)展的迫切需要，鈦及其合金的制備工藝有了很大的進(jìn)步。純度的提高以及性能的改善使鈥逐步在外科手術(shù)和齒科上得到應(yīng)用。作為生物醫(yī)用材料，與常用的不銹鋼和鉆基合金相比，鐵及其合金具有低的模量、良好生物相容性和抗腐姓性等優(yōu)點(diǎn)，因而在醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用逐漸獲得了推廣，巳被廣泛地應(yīng)用于硬組織替換、心臟瓣族、血管支架以及各種矯形器械等。
1.2.2醫(yī)用鈥及鈥合金的表面改性現(xiàn)狀
雖然金屬釹及鐵合金備受關(guān)注并在植入體手術(shù)中巳經(jīng)得到了廣泛地應(yīng)用，但其與人體組織結(jié)構(gòu)差異很大，且表面是化學(xué)惰性的[4]，而人體骨組織與鈥及鈥植入體的相互作用一般發(fā)生在兩者相接處的界面處，因此這個界面的性能直接決定了植入體手術(shù)能否成功。研究表明，植入體表面物理性質(zhì)和化學(xué)性質(zhì)對生物材料的性能共同起著決定性的作用[5]，對種植體表面進(jìn)行合適改性，有利于人體骨組織與植入體形成化學(xué)鍵合。
研究表明，通過對植入體進(jìn)行表面改性處理，可以提高其生物活性改性的方法主要有物理表面改性和化學(xué)表面改性。物理表面改性主要是通過表面腐蝕、等離子體轟擊等方式改變金屬植入體表面的形貌、粗糙度等來促進(jìn)植入體表面對于蛋白、細(xì)胞等的枯附性能，從而影響細(xì)胞在表面的生存狀態(tài)�；瘜W(xué)表面改性主要是在植入體表面通過溶膠凝膠、電化學(xué)等手段改變植入體表面制備一層生物活性涂層[8]，使宿主組織可以和植入體形成骨性鍵合。
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第二章實驗與測試

2.1實驗原料
本實驗所釆用的主要試劑如表2-1所示。
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2.2實驗方法
2.2.1鈥基板和鈥棒的表面處理
本實驗釆用的基板為市售的Ti片或Ti棒（3x22imn)(純度>99.99%)，預(yù)處理后用于電化學(xué)沉積。首先將Ti片用金屬切割機(jī)切割成20x10x0.1 mm3的片狀，不平的邊緣經(jīng)打磨平整后用無水乙醇超聲20min清除表面油污。再用去離子水清洗后將Ti片作酸處理和堿處理。
Ti片的酸處理所用試劑為2.75 MHF和3.94 M HNO3的混酸溶液。將Ti片放入適量的混酸溶液中，待反應(yīng)完成無氣泡產(chǎn)生后取出Ti片，并清洗其表面殘余混酸溶液。酸處理可以進(jìn)一步去除Ti片表面油污，同時可去除表面因暴露于空氣而形成的氧化層。上述操作均在通風(fēng)櫥內(nèi)進(jìn)行。
酸處理后進(jìn)行堿熱處理。將酸處理好的Ti片浸泡于5M的NaOH濃溶液中，置于60 °(：的恒溫箱中保溫24小時后取出，再用去離子水沖洗以去除表面殘余NaOH。將完成堿處理的Ti片干燥后置于馬弗爐中于500°C條件下保溫2小時，并隨爐冷卻。堿熱處理可以使Ti片表面形成一層多孔Ti02層。該氧化層有利于礦化肢原涂層的沉積，同時Ti基板表面礦化膠原涂層在體內(nèi)降解后可作為生物活性層進(jìn)一步發(fā)揮骨整合的作用。
2.2.2 礦化膠原涂層的制備
2.2.2.1電解液的配制
將I型膠原牛跟腱酶解在0.005M的醋酸溶液中，室溫攪拌5h后得到0.5mg/ml的膠原溶液，放置于4°C的冰箱中備用。
Ca(N03)2和NH4H2PO4作為電解液轉(zhuǎn)碟元素的來源，將Ca(N03)2*4H20和NH4H2PO4分別溶于去離子水制備得到80 mM Ca(N03)2溶液和160 mMNH4H2PO4溶液，作為轉(zhuǎn)碟先驅(qū)體溶液。
將上述制備得到的Ca(N03)2、NH4H2PO4和膠原溶液按照體積比1:1:8混合得到最終的電解液，在磁力條件攬拌下，用濃度為0.25M的NaOH溶液將其pH調(diào)整至4.3"4.5。最后在電解液中加入適量H2O2改變陰極反應(yīng)類型以調(diào)節(jié)陰極附近pH大小。
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第三章 共沉積法制備承載VH涂層及其性能表征................... 37-49 
3.1 涂層制備及其形貌成分分析................................ 37-40 
3.2 涂層的細(xì)胞相容性........................... 40-42 
3.3 涂層抗菌藥物釋放行為.............................. 42-43 
3.4 涂層抗菌藥物釋放行為的動力學(xué)分析.................... 43-44 
3.5 涂層抗菌效能的評價......................... 44-47 
3.6 本章小結(jié)................................. 47-49 

第四章 電泳注入法制備承載rhBMP-2涂層及其性能表征

4.1涂層制備及其形貌成分分析
通過第三章中電化學(xué)共沉積的探索發(fā)現(xiàn)，雖然共沉積的方法可以將殼聚糖微球和膠原纖維緊密地結(jié)合在一起，并在鈥基板上形成一層礦化膠原-殼聚糖微球涂層，但是在共沉積過程中，殼聚糖微球會影響到膠原纖維的礦化過程，在實驗過程中也發(fā)現(xiàn)，共沉積法制備的涂層偏薄，而且針對rhBMP-2主要作用在前骨細(xì)胞分化階段的特點(diǎn)，需要設(shè)計出一種更適合承載rhBMP-2的結(jié)構(gòu)。
針對共沉積涂層可能影響膠原的礦化這一問題，可以釆用先行沉積出不含有微球的擴(kuò)化膠原涂層，再將載有rhBMP-2的殼聚糖微球注入到多孔的礦化膠原涂層中的做法�？梢圆捎玫膬蓚€方法是1.將礦化膠原涂層浸泡到殼聚糖徵球溶液中。2.通過調(diào)整殼聚糖溶液的:pH值，使殼聚糖微球帶電，再采用電化學(xué)的方法，將黴球電、泳注入進(jìn)礦化膠原涂層。
圖4.1為以下沉積條件下所獲得的涂層形貌：電解液為4 mMCa2+，8 mMPO4'", 0.4 mg/mL膠原，電解液pH為4.5，沉積溫度為37°C,沉積時間為30min，沉積電壓為2.1V。沉積完成后，自然風(fēng)干。將涂層浸泡在殼聚糖徵球濃度為0.12mg/ml溶液中3h，即得到圖4.1(a)的形貌。將涂層浸入殼聚糖黴球濃度為0.12mg/ml溶液中，利用電化學(xué)工作站加載0.5V的電壓沉積3h，即可得圖4.10)所示的形貌。從圖中可以得出，通過浸泡法得到的礦化膠原-殼聚糖黴球涂層，殼聚糖微球停留在5廣化膠原涂層表面，且微球出現(xiàn)了團(tuán)聚的狀況，該種結(jié)構(gòu)不利于rhBMP-2深入分布到礦化膠原涂層內(nèi)部。通過電泳注入的方式，微球分散均句，進(jìn)入到了礦化膠原涂層的孔洞當(dāng)中且緊貼孔壁，該種結(jié)構(gòu)利于rhBMP-2深入分布于"化膠原涂層內(nèi)部，可為提高rhBMP-2承載量，優(yōu)化rhBMP-2釋放曲線打下結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。
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結(jié)論

本文通過金屬植入體表面的礦化膠原涂層有著良好的生物相容性出發(fā)，針對其承載/釋放抗菌藥物及生長因子效能不夠理想的現(xiàn)狀，利用殼聚糖微球豐富的旁側(cè)基團(tuán)，較大的比表面積以及良好的生物相容性，對f化膠原涂層進(jìn)行表面改性，以期在保留礦化股原涂層良好生物相容性的基礎(chǔ)上提高其載藥/BMP及釋藥/BMP的性能，從而延長礦化腔原涂層的有效抗菌時間及提高其促進(jìn)骨整合的性能。同時利用數(shù)學(xué)模型對釋藥/BMP的行為進(jìn)行分析。本文主要研究內(nèi)容及結(jié)論如下：
1.通過電化學(xué)共沉積碟酸錢、膠原、殼聚糖微球的方式，利用殼聚糖微球豐富的旁側(cè)基團(tuán)(-NH2、-COOH)及其合適的粒徑大小(幾十納來到幾百納來)，殼聚糖微球可以有效地嵌入到礦化膠原涂層網(wǎng)絡(luò)中，而且其與裸露的膠原結(jié)合牢固。通過電泳注入的方式，殼聚糖徵球也可以被組裝入礦化膠原涂層中去，并在礦化膠原的孔洞中大量存在。這兩種在礦化膠原涂層中嵌入殼聚糖徵球的方式降低了礦化膠原涂層的孔隙率，提高了礦化膠原涂層孔徑的曲折度，而且兩種制備礦化膠原/殼聚糖徼球的方式都不會改變礦化膠原涂層的相組成。
2.通過共沉積的方式制備的f化膠原/殼聚糖微球涂層在維持礦化膠原涂層良好相容性的同時可以優(yōu)化藥物釋放曲線,減緩藥物的初期的"爆發(fā)性”釋放。通過電泳注入制備的礦化膠原/殼聚糖徵球涂層可以顯著提高rliBMP-2的承載量，單位面積承載量達(dá)到1186iig/cm2，是不含微球涂層承載量的2.7倍，而且f化膠原/殼聚糖徵球涂層顯著減緩了 rhBMP-2的初期“爆發(fā)性”釋放，使持續(xù)釋放天數(shù)迖到了 30天以上。
3.通過共沉積法制備的礦化膠原/殼聚糖微球涂層由于減緩了藥物的爆發(fā)性釋放，在不影響礦化膠原涂層良好相容性的基礎(chǔ)上增長了植入體表面的有效抗菌時間。通過電泳注入法制備的礦化膠原/殼聚糖微球涂層由于rhBMP-2承載量的提高，使表面細(xì)胞的枯附及增殖、分化、礦化程度得到提高，并最終加速了植入體的骨整合速度，并可以使植入體在植入手術(shù)8周之后基本完成骨整合過程。
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本文編號：10937