【摘要】 乳腺癌是一種高度異質(zhì)性的惡性腫瘤,其發(fā)病率逐漸上升,且是女性癌癥死亡的第二殺手。尋找有效的治療靶點和適宜的治療藥物,對不同患者采取個體化綜合治療,已成為研究熱點。在眾多的腫瘤靶蛋白中,膜型Ⅰ基質(zhì)金屬蛋白酶(Membrane type-1matrix metalloproteinase, MT1-MMP)參與腫瘤發(fā)生、發(fā)展、浸潤以及血管生成等多種過程,是一個理想的藥物靶點。中醫(yī)中藥有著獨特的療效,廣泛用于治療乳腺癌。分子靶向和中藥治療可望為乳腺癌治療帶來新的前景。本文首先通過計算機輔助藥物設(shè)計進行靶向MT1-MMP的反義肽篩選和研究,采用分子對接、分子動力學(xué)模擬、體外細(xì)胞實驗等方法,確定反義肽對MT1-MMP和乳腺癌細(xì)胞的靶向性；其次,以MT1-MMP為橋梁,探討藥用植物提取液(試劑2號)對MT1-MMP陰、陽性兩種乳腺癌細(xì)胞株的藥效作用與分子作用機制,通過MTT、 AO-EB雙染、DNA Ladder、流式細(xì)胞、熒光定量PCR (Fluorescence Quantitative PCR, FQ-PCR)、 Western blot等方法,確定試劑2號的藥效作用、作用靶點和細(xì)胞死亡途徑。多序列比對確定了位于MT1-MMP環(huán)區(qū)的特異序列AYIREGHE(簡稱MT1-loop),并構(gòu)建1536條反義肽。通過兩輪虛擬篩選,獲得了分值較好的5條反義肽。將五條反義肽與其他MMPs成員進行分子對接,發(fā)現(xiàn)反義肽FVTFPYIR特異性更好；隨后分子動力學(xué)模擬結(jié)果顯示,FVTFPYIR可能影響MT1-MMP的穩(wěn)定性。在以上的基礎(chǔ)上,合成評價最優(yōu)的反義肽FVTFPYIR進行細(xì)胞實驗,發(fā)現(xiàn)該肽能夠?qū)Ρ磉_MT1-MMP的乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231具有較好的抑制作用,同時又有特異親和力。通過MTT法和形態(tài)觀察發(fā)現(xiàn),試劑2號能夠顯著抑制乳腺癌MDA-MB-231和MCF-7細(xì)胞的活力,作用24h的IC50分別為3.45%和2.84%,作用48h的IC50分別為2.36%和2.32%,形態(tài)上也發(fā)生明顯改變,具有時間-劑量依賴關(guān)系。在此基礎(chǔ)上,進一步通過瓊脂糖凝膠電泳、AO-EB雙染和流式細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)3%試劑2號能夠誘導(dǎo)乳腺細(xì)胞凋亡,同時非凋亡途徑也參與了細(xì)胞死亡。隨后,FQ-PCR結(jié)果表明,在MDA-MB-231細(xì)胞中,3%試劑2號與陽性對照DOX類似,能夠提高MMP2、MMP9、MT1-MMP、 caspase3和caspase8基因的相對表達量；在MCF-7細(xì)胞中,3%試劑2號與DOX可提高MMP2、MMP9、caspase8、caspase9、p53和bcl-2基因相對表達量,下調(diào)caspase3基因。在蛋白水平上,在MDA-MB-231細(xì)胞中,試劑2號上調(diào)MT1-MMP和p53蛋白,下調(diào)caspase3,對bcl-2表達無影響；在MCF-7細(xì)胞中,上調(diào)caspase3,下調(diào)bcl-2,p53蛋白24h表達下降,48h表達增加。由此可以看出,試劑2號對兩株細(xì)胞作用方式不盡相同。主要結(jié)論：靶向MT1-MMP反義肽可望成為抗腫瘤多肽藥物研發(fā)的一條有用途徑,藥用植物提取液(試劑2號)對乳腺癌細(xì)胞具有很好的殺傷作用,其作用機制與MT1-MMP、p53、caspase、bcl-2等多種分子表達與抑制有關(guān),進一步的分子作用機理尚有待進一步研究。 

第一章緒論

1.1孰腺癌研究進展
1.1.1孰腺癌現(xiàn)狀
1.1.2乳腺癌發(fā)病因素
研究發(fā)現(xiàn)，多種因素可導(dǎo)致乳腺癌的發(fā)病。首先，不能忽視遺傳因素的作用。通常情況下家族中有人患過乳腺癌，那么他的直系親屬患乳腺癌概率就比普通人高兩到三倍[3]。其次生育因素，未育、晚育以及第一胎足月妊娠大于30歲的人群也易患病。此外，生過孩子不哺乳，同樣也會增加乳腺癌發(fā)病率。再次是月經(jīng)因素。月經(jīng)初潮年齡小于12歲或停經(jīng)在55歲以后的人群有患病的風(fēng)險。據(jù)報道，月經(jīng)初潮年齡小于12歲與大于17歲相比，乳腺癌發(fā)生的相對危險增加2.2倍。閉經(jīng)年齡大于55歲比小于45歲者發(fā)生乳腺癌的危險性增加1倍。同時，得過乳腺良性疾病的人群也有高發(fā)風(fēng)險，比如乳腺增生，乳腺纖維瘤等。然而專家稱，只有小部分乳腺癌的的發(fā)病與以上因素有關(guān)，更多的是由環(huán)境因素造成。己證實環(huán)境中有216種化合物與乳腺癌發(fā)生有關(guān)，如多氯聯(lián)苯、全氟辛酸、聚氯乙稀等。
1.1.3乳腺癌的分型
根據(jù)免疫組化可將乳腺癌分為四個類型，即Luminal A型，Luminal B型，HER2型和Basal型（三陰型）[4]。Luminal A型和Luminal B型均是雌激素受體（EstrogenReceptor, ER)或孕激素受體（Progesterone receptor, PR)呈陽性的，兩者的區(qū)別是后者的人表皮生子因子受體-2 (Human epidermal growth factor receptor, HER-2)呈陽性；HER2型顧名思義是HER2呈陽性，而ER和PR表達缺失；Basal型是為ER、PR和HER2均為陰性，這類型的乳腺癌惡性程度高、侵襲能力強、預(yù)后性差等特點，目前尚無有效的治療方案。免疫組化分型能夠更好地體現(xiàn)乳腺癌的生物學(xué)特點，可以判斷預(yù)后和指導(dǎo)乳腺癌個體化治療。
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1.2 MT1-MMP與乳腺癌
1.2.1 MMPs 簡介
基質(zhì)金屬蛋白酶（Matrix metalloproteinases, MMPs)是一類Zn2+依賴性的多功能內(nèi)肽酶，它們的作用目標(biāo)是裂解細(xì)胞外基質(zhì)（Extracellular matrix, ECM)、生長因子、細(xì)胞因子、細(xì)胞表面相關(guān)的點附以及信號受體。通常，它們在胚胎階段和組織重塑過程中表達，如排卵期、子宮內(nèi)膜循環(huán)和傷口愈合。重要的是它們通常在多種腫瘤中過 ?量表達，被認(rèn)為是腫瘤轉(zhuǎn)移過程多步驟中的重要成員，同時它們也參與調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、釋放生長因子和血管生成等過程[14]。MMPs活性在多個水平上被調(diào)控，主要是通過激活酶原和與金屬蛋白酶組織內(nèi)源性抑制劑（tissue inhibitors of metalloproteinases，TIMPs)相互作用。
根據(jù)結(jié)構(gòu)特性，MMPs可分為分泌型和膜型MMPs。分泌型MMPs可以擴散并影響遠(yuǎn)程組織和細(xì)胞，相比之下，膜型MMPs局限于表達它的細(xì)胞表面，因而只能調(diào)節(jié)自身附近的蛋白水解活性。
1.2.2 MT1-MMP 特性
膜型 I 基質(zhì)金屬蛋白酶（Membrane type-1 matrix metalloproteinase, MTl-MMP,MMP14)作為首個被鑒別出來的膜型基質(zhì)金屬蛋白酶，直接或間接降解許多ECM大分子，如I、II、m型膠原，層粘連蛋白1和5，纖連蛋白，玻連蛋白，纖維蛋白和聚集蛋白聚糖MT1-MMP具有MMPs成員的典型結(jié)構(gòu)：前肽結(jié)構(gòu)區(qū)、催化結(jié)構(gòu)域(catalytic domain, CAT)、鉸鏈結(jié)構(gòu)域和血紅素樣結(jié)構(gòu)域（hemopexin-like domain,HPX),同時具有跨膜區(qū)、胞質(zhì)尾端以及furin蛋白識別等位點（圖1-2)。其中催化結(jié)構(gòu)域是MT1-MMP致癌特性最重要的區(qū)域，被認(rèn)為是惡性腫瘤適宜的藥物祀點而成為國內(nèi)外研究的熱點。隨著HPX、跨膜胞質(zhì)區(qū)等其他區(qū)域作用功能的逐漸闡明，MT1-MMP在整個腫瘤發(fā)生、發(fā)展中的重要作用被更加確定。
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第二章靶向MT1-MMP反義肽的虛擬篩選及其對乳腺癌細(xì)胞的抑制作用

2.1引言
反義肽即DNA反義鏈編碼的多肽，如同DNA正義鏈和反義鏈那樣，其與正義肽也存在相互作用。目前有Mekler-Idlis (M-I)配對理論、AHBs (反義同源盒）理論和分子識別理論對其作用原理和機制進行了較為詳細(xì)的描述[73]，其相互作用主要是疏水性、靜電引力、氫鍵。反義肽和正義肽之間特殊的作用模式，己被用于多個領(lǐng)域。羅勝明等[74]研究發(fā)現(xiàn)VEGF_C反義肽可抑制骨肉瘤細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移能力，并且抑制腫瘤組織VECFR-3陽性血管的形成，發(fā)揮抗骨肉瘤作用。作為一種新型多肽先導(dǎo)藥物來源，反義肽在生物醫(yī)藥等領(lǐng)域具有重要的研發(fā)前景。
國內(nèi)外有大量的 MMPs 抑制劑（matrix metalloproteinase inhibitors, MMPIs)研究報道，但大部分的MMPIs被扼殺在II、III臨床階段，其主要原因是MMPs家族序列同源性高、功能區(qū)域三級結(jié)構(gòu)相似，所研發(fā)的MMPIs缺乏選擇性，以致特異性低和毒副作用大。篩選和獲得高選擇性的MMPIs己成為該領(lǐng)域研發(fā)的關(guān)鍵。本節(jié)以MT1-MMP膜表面蛋白為對象，采用生物信息學(xué)與基于反義肽理論的虛擬篩選技術(shù)，篩選與發(fā)現(xiàn)分子靶向MT1-MMP特異區(qū)域的結(jié)合肽，期望為靶向MT1-MMP抗腫瘤反義肽先導(dǎo)藥物的研發(fā)提供了一種新的思路與途徑。
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2.2實驗材料
2.2.1蛋白信息
MMPs 蛋白序列：下載自 NCBI 蛋白數(shù)據(jù)庫()，MMPs 三維結(jié)構(gòu)：下載自 PDB 數(shù)據(jù)庫Oittt)://www.rcsb.org/Txlb/home/home.do)，蛋白序列及三維結(jié)構(gòu)信息見表2-1。
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第三章 試劑2號對乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231(MT1-MMP~+)和MCF-7(MT1-MMP~-)作用機理的探討.......................... 45-76 
3.1 引言................. 45 
3.2 材料 ..........................45-47 
3.2.1 主要儀器 ......................45 
3.2.2 主要試劑 ............................45-46 
3.2.3 主要試劑配制........................ 46-47 
3.3 實驗內(nèi)容 ........................47-55 
3.3.1 氣象色譜法測定乙醇含量.................... 47-48 
3.3.2 試劑2號對MCF-7和MDA-MB-231細(xì)胞活力的影響..................... 48 
3.3.3 AO-EB細(xì)胞雙染 ............................48 
3.3.4 電泳檢測MCF-7和MDA-MB-231細(xì)胞DNA Ladder ..............................48-49 
3.3.5 FCM檢測乳腺癌細(xì)胞死亡 ........................49-50 
3.3.6 FQ-PCR檢測試劑2號作用后乳腺癌多基因表達變化 ...............50-53 
3.3.7 Western Blot檢測乳腺癌細(xì)胞相關(guān)蛋白的表達.............. 53-55 
3.4 實驗結(jié)果與分析...................... 55-71 
3.4.1 乙醇含量測定 .......................55-57 
3.4.2 試劑2號抑制MCF-7和MDA-MB-231細(xì)胞活力 ..................57-63 
3.4.3 AO-EB熒光雙染結(jié)果 .............................63 
3.4.4 試劑2號作用MCF-7和MDA-MB-231細(xì)胞后的DNA Ladder ..............................63-64 
3.4.5 FCM檢測試劑2號對MCF-7和MDA-MB-231細(xì)胞死亡的影響............................... 64-65 
3.4.6 FQ-PCR檢測MCF-7和MDA-MB-231細(xì)胞多基因表達發(fā)生改變 .................65-70 
3.4.7 Western blot實驗結(jié)果 ........................70-71 
3.5 討論.................................... 71-74 

3.6 結(jié)論

(1)試劑2號對MDA-MB-231和MCF-7細(xì)胞增殖具有很好的殺傷作用，均呈現(xiàn)劑量-時間依賴關(guān)系；
(2)試劑2號通過凋亡和非凋亡途徑調(diào)控MDA-MB-231和MCF-7細(xì)胞的增殖，非凋亡途徑可能起主要作用，需要進一步研究；
(3)試劑2號作用MDA-MB-231和MCF-7細(xì)胞靶點方式有相同的如MMP2、MMP9,也有不同的如p53、bcl-2和caspase3等。
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總結(jié)

靶向MT1-MMP反義肽可望成為抗腫瘤多肽藥物研發(fā)的一條有用途徑，藥用植物提取液（試劑2號）對乳腺癌具有很好的療效作用，其對乳腺癌細(xì)胞殺傷作用與MT1-MMP、p53、caspase家族成員、bcl-2等多種分子表達與抑制有關(guān)，進一步的分子作用機理尚有待進一步研宄。全文結(jié)論如下：
1.經(jīng)過兩輪虛擬篩選獲得了分值較好的五條反義肽；該五條與其他MMPs成員分子對接，發(fā)現(xiàn)FVTFPYIR特異性更好；與MT1-MMP分子動力學(xué)模擬，初步認(rèn)為FVTFPYIR可能會影響MT1-MMP的穩(wěn)定性；
2.體外細(xì)胞實驗顯示，反義肽FVTFPYIR對表達MT1-MMP蛋白的MDA-MB-231和MG-63細(xì)胞活力具有較好的抑制作用，同時對MDA-MB-231細(xì)胞具有特異的親和力，呈現(xiàn)劑量和時間依賴關(guān)系；
3.試劑2號對MDA-MB-231和MCF-7細(xì)胞增殖具有很好的殺傷作用，均呈現(xiàn)劑量-時間依賴關(guān)系；試劑2號通過凋亡和非凋亡途徑調(diào)控MDA-MB-231和MCF-7細(xì)胞的活力，非凋亡途徑可能起主要作用，筆耕文化傳播，需要進一步研宄；
4.試劑2號作用MDA-MB-231和MCF-7細(xì)胞靶點方式有相同的如MMP2、MMP9,也有不同的如p53、bcl-2和caspase3等。
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本文編號：10888