【摘要】 細(xì)胞色素P450酶(cytochrome P450, CYP450)是機(jī)體重要的藥物代謝酶,涉及內(nèi)源性和外源性物質(zhì)以及幾乎所有藥物和其衍生物的代謝。另一方面,內(nèi)源性、外源性化合物也能夠誘導(dǎo)或抑制CYP450的表達(dá),而嚴(yán)重影響著藥物的代謝、療效和安全性。CYP3A29是豬體內(nèi)最重要最豐富的藥物代謝酶之一,是人重要藥物代謝酶CYP3A4的研究模型。干擾素(Interferon, IFN)作為新型生物藥物已被廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)臨床及獸醫(yī)臨床,使用過(guò)程中通常需要與其它藥物聯(lián)合應(yīng)用,以達(dá)到更好的效果,但其對(duì)機(jī)體藥物代謝酶的表達(dá)調(diào)控機(jī)制尚不清楚,由此導(dǎo)致的藥物代謝酶的表達(dá)及活性的變化嚴(yán)重影響著對(duì)藥物的代謝、療效和安全性,經(jīng)常導(dǎo)致藥效降低、產(chǎn)生毒副反應(yīng)及藥物殘留,給臨床合理用藥帶來(lái)了很大困難,既造成了藥物的浪費(fèi),又嚴(yán)重影響人和動(dòng)物的健康。因此研究干擾素對(duì)豬CYP3A29表達(dá)調(diào)控的影響及其機(jī)制的調(diào)節(jié),既能指導(dǎo)獸醫(yī)臨床用藥,又能為醫(yī)學(xué)臨床合理用藥提供理論依據(jù)。本研究從細(xì)胞水平及動(dòng)物活體水平研究了干擾素對(duì)CYP3A29表達(dá)的影響,并探討了其分子機(jī)制,取得的結(jié)果如下：1. IFN-a與IFN-y在細(xì)胞水平對(duì)CYP3A29表達(dá)的影響分離制備豬肝原代細(xì)胞,MTT還原法分別檢測(cè)IFN-a與IFN-y對(duì)豬肝細(xì)胞活性影響,證實(shí)IFN-a與IFN-y對(duì)其無(wú)細(xì)胞毒性作用；分別用不同劑量IFN-a與IFN-y在不同時(shí)間點(diǎn)處理豬原代肝細(xì)胞和傳代肝細(xì)胞HepLi,應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR和Westen-blot檢測(cè)肝細(xì)胞的CYP3A29在mRNA水平和蛋白質(zhì)的變化,結(jié)果表明IFN-a與IFN-y均能顯著上調(diào)CYP3A29表達(dá),且具有一定的時(shí)間、劑量相關(guān)性。2. IFN-a與IFN-y在動(dòng)物活體水平對(duì)CYP3A29表達(dá)及酶活性的影響分別用IFN-a與IFN-y肌肉注射30日齡仔豬,采用差速離法(Differential celltrifugation method)制備豬肝微粒體。應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR和Westen-blot測(cè)定CYP3A29mRNA和蛋白質(zhì)水平變化,結(jié)果表明IFN-a與IFN-y均能顯著上調(diào)CYP3A29表達(dá),且與細(xì)胞水平相一致；以人CYP3A4的特異性底物硝苯地平作為探針,尼群地平作為內(nèi)標(biāo),用高效液相色譜法測(cè)定硝苯地平氧化代謝產(chǎn)物氧化型硝苯地平含量,分析CYP3A29酶活性變化,表明豬CYP3A29基因與人CYP3A4基因致,具有硝苯地平氧化代謝活性,且IFN-a與IFN-y能激活CYP3A29酶代謝活性。3. IFN-a與IFN-y對(duì)孕烷受體PXR表達(dá)的影響分別用不同劑量IFN-a與IFN-y在不同時(shí)間點(diǎn)處理豬原代肝細(xì)胞和傳代肝細(xì)胞HepLi,應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR和Westen-blot檢測(cè)PXR在mRNA水平和蛋白質(zhì)的變化,結(jié)果表明IFN-α與IFN-γ均能顯著上調(diào)PXR表達(dá),且與CYP3A29的表達(dá)具有一致性；動(dòng)物實(shí)驗(yàn)樣品熒光定量PCR和Westen-blot檢測(cè)結(jié)果與細(xì)胞水平檢測(cè)結(jié)果相一致。4. IFN-α與IFN-γ對(duì)CYP3A29表達(dá)調(diào)控機(jī)制分別構(gòu)建PXR真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1-PXR及6個(gè)CYP3A29不同長(zhǎng)度啟動(dòng)子熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒；在MTT還原法檢測(cè)轉(zhuǎn)錄抑制劑DRB對(duì)豬肝細(xì)胞無(wú)細(xì)胞毒性作用基礎(chǔ)上,通過(guò)轉(zhuǎn)錄抑制試驗(yàn)確定肝臟藥物代謝酶CYP3A29的啟動(dòng)子在IFN-α與IFN-γ調(diào)控中的作用,采用細(xì)胞轉(zhuǎn)染PXR真核表達(dá)質(zhì)粒和siPXR使核受體PXR超表達(dá)或者沉默,轉(zhuǎn)染不同長(zhǎng)度的CYP3A29啟動(dòng)子片段,探討IFN-α與IFN-γ上調(diào)CYP3A29表達(dá)的分子機(jī)制。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：(1) IFN-α與IFN-γ通過(guò)激活CYP3A29啟動(dòng)子上調(diào)CYP3A29的表達(dá),IFN-α與IFN-γ激活CYP3A29轉(zhuǎn)錄部位是位于轉(zhuǎn)錄起始上游-1473至-1021區(qū)域；(2) IFN-α與IFN-γ處理細(xì)胞后,PXR mRNA上調(diào)先于CYP3A29mRNA發(fā)生,推斷PXR作為轉(zhuǎn)錄因子參與激活CYP3A29表達(dá)；(3)PXR超表達(dá)試驗(yàn)和RNA干擾試驗(yàn)表明IFN-α與IFN-γ激活CYP3A29的表達(dá)與核受體PXR相關(guān)。

第一章文獻(xiàn)綜述

1.1 干擾素（Interferon，IFN)
干擾素（Interferon，IFN)是由細(xì)胞基因控制、在特定誘導(dǎo)劑的作用下產(chǎn)生的一類(lèi)細(xì)胞因子，具有廣譜抗病毒、抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)等多種生物活性。隨著基因工程技術(shù)的發(fā)展，干擾素生物學(xué)活性、產(chǎn)生及其作用機(jī)理得到了闡明，為其臨床應(yīng)用提供了理論依據(jù)。目前作為新型生物藥物，干擾素已被廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)臨床病毒性疾病及腫瘤的治療，筆耕文化推薦期刊，在獸醫(yī)臨床中被廣泛用于病毒性疾病的預(yù)防和治療（陳雪2006;張真2007;張海玲和聞喜軍2008)。
上個(gè)世紀(jì)80年代美國(guó)國(guó)家過(guò)敏癥與傳染病研究所和世界衛(wèi)生組織根據(jù)抗原的特異性，把干擾素分為三類(lèi)：IFN-a、IFN-p和IFN-y。后來(lái)，又根據(jù)干擾素共同享用受體的不同被分為I型、II型和III型干擾素。I型包括IFN-a、IFN-P、IFN-O)和IFN-x, II 型包括 IFN-y (Jonasch and Haluska 2001 )； III 型指 IFN-?o。幾乎所有類(lèi)型細(xì)胞都可以分泌I型干擾素，具有代表性的是白細(xì)胞和成纖維細(xì)胞分泌的IFN-a和IFN-P，而IFN-y由T-細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞（NK)分泌，IFN-X主要在對(duì)病毒的自然免疫中在肝細(xì)胞、單核細(xì)胞等為數(shù)不多的幾種細(xì)胞中有分泌（Sheppardetal2003)。
干擾素基因基本上都是由四部分組成：5’非編碼區(qū)、成熟肽編碼區(qū)、信號(hào)肽編碼區(qū)和3’非編碼區(qū)。5’非編碼區(qū)具有一定的保守區(qū)域，它對(duì)干擾素基因轉(zhuǎn)錄的起始調(diào)控和識(shí)別具有重要的作用，一些保守區(qū)的序列可能與病毒誘生有關(guān)。信號(hào)肽在不同的干擾素中數(shù)目也不相同，信號(hào)肽指導(dǎo)干擾素前體運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞膜，然后被切除，使成熟的干擾素分泌到細(xì)胞外。不同干擾素的氨基酸數(shù)目、組成種類(lèi)各不相同，其結(jié)構(gòu)也各有差異（胡慧珍和思汗2009)。
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1.2 細(xì)胞色素 P450 (cytochrome P450, CYP450)
細(xì)胞色素P450是亞鐵血紅素-硫醇鹽蛋白（heme-thiolate proteins)的超家族的成員，它們?cè)诮^大多數(shù)的內(nèi)源性物質(zhì)的代謝中起到重要的作用，如氧化作用、超氧化作用及還原作用等；這些內(nèi)源性物質(zhì)包括：脂肪酸、類(lèi)固醇激素、前列腺素、膽汁酸以及脂溶性的維生素等。細(xì)胞色素P450對(duì)保持多種化合物在不同的細(xì)胞過(guò)程中的平衡起到重要的維護(hù)作用。此外，細(xì)胞色素P450中很多酶對(duì)外源性物質(zhì)如藥物、致癌物質(zhì)以及環(huán)境污染物的代謝起到重要作用，這些外源性物質(zhì)在P450酶的作用下，通過(guò)I相代謝作用，使親脂性的物質(zhì)轉(zhuǎn)化成水溶性物質(zhì)以利于排除體外(Goodwin et al 2002)。細(xì)胞色素P450受到了研究者的廣泛關(guān)注，截止到2013年底，大約有6.9萬(wàn)篇關(guān)于細(xì)胞色素P450的研究報(bào)道（Renault etal 2014)，最初的報(bào)道主要見(jiàn)于細(xì)胞色素P450在哺乳動(dòng)物中與代謝有關(guān)的醫(yī)學(xué)和藥理學(xué)研究，現(xiàn)在植物、微生物領(lǐng)域都有相關(guān)研究報(bào)道。
1.2.1細(xì)胞色素P450的發(fā)現(xiàn)與分布
1958年，Klingberg和Grfinkle分別在大鼠和豬上發(fā)現(xiàn)一種膜結(jié)合的微粒體蛋白組分，它與一氧化碳結(jié)合后在450nm處有一明顯的吸收峰，隨后這種蛋白被證實(shí)為細(xì)胞色素P450。由于其獨(dú)特的在光譜450nm處有吸收峰，因此被命名為P450。
細(xì)胞色素P450分布十分廣泛，在動(dòng)物、植物、微生物中均已發(fā)現(xiàn)它的存在。在脊椎動(dòng)物中，細(xì)胞色素P450含量最豐富的器官是肝臟，這與其功能相適應(yīng)，其次是小腸。在其他器官或組織中也均有分布，如：腎臟、肺、胎盤(pán)、皮膚、腎上腺、睪丸、大腦以及主動(dòng)脈等（任彭和劉兆平2006)。
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第二章IFN-a對(duì)豬肝臟關(guān)鍵藥物代謝酶CYP3A29表達(dá)的影響

2.1前言
干擾素（Interferon，IFN)是由細(xì)胞基因控制、在特定誘導(dǎo)劑的作用下產(chǎn)生的一類(lèi)細(xì)胞因子，具有廣譜抗病毒、抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)等多種生物活性。根據(jù)干擾素共同享用受體的不同被分為I型、n型和III型干擾素，IFN-a屬于I型干擾素，有強(qiáng)大的抗病毒作用。隨著基因工程技術(shù)的發(fā)展，IFN生物學(xué)活性、產(chǎn)生及其作用機(jī)理得到了闡明，為其臨床應(yīng)用提供了理論依據(jù)。目前作為新型生物藥物，IFN已被廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)臨床病毒性疾病及腫瘤的治療（Campbell et al 1999； Yoshiji et al 2005；Radaeva et al 2002；劉金旭和陳文梅2010)。并且在獸醫(yī)臨床中被應(yīng)用于病毒性疾病的預(yù)防和治療（陳雪2006;張真2007;張海玲和閆喜軍2008)。盡管如此，對(duì)于IFN仍有許多問(wèn)題亟待解決。尤其是在臨床上，IFN經(jīng)常需要與其它藥物聯(lián)合應(yīng)用，以達(dá)到更好的效果。但是IFN對(duì)機(jī)體藥物代謝酶的表達(dá)調(diào)控及分子機(jī)制尚不清楚，由此導(dǎo)致的藥物代謝酶的表達(dá)及活性的變化嚴(yán)重影響著對(duì)藥物的代謝、療效和安全性，經(jīng)常導(dǎo)致藥效降低或產(chǎn)生毒副反應(yīng)，給臨床合理用藥帶來(lái)了很大困難，既造成了藥物的巨大浪費(fèi)，又嚴(yán)重影響著人和動(dòng)物的健康。
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2.2實(shí)驗(yàn)材料
2.2.1細(xì)胞系
傳代肝細(xì)胞系HepLi由浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院李蘭娟教授饋贈(zèng)。
2.2.2分子生物學(xué)相關(guān)試劑
rTaq DNA 聚合酶（Takara)，RNA 提取試劑 RNAiso Plus Reagent (TaKaRa),PrimeScript反轉(zhuǎn)錄酶(TaKaRa),熒光定量試劑(Bio-Rad)，青鏈毒素溶液(Hyclone),DL2000(東盛)，DL15000(東盛)，dNTP(TaKaRa),細(xì)胞裂解緩沖液 RIPA Buffer(Pierce),蛋白酶抑制劑（Pierce)，蛋白酶 K (sigma), IFN-a 購(gòu)自 Kingfisher 公司，CYP3A29 抗體、P-actin 抗體、PXR 抗體購(gòu)自 Santa Cruz Biotechnology 公司，羊抗鼠_標(biāo)二抗購(gòu)自武漢三鷹公司，DMEM高糖培養(yǎng)基、DPBS緩沖液、OPTI-MEM、胎牛血清購(gòu)自美國(guó)GIBCO公司，P-NADP、G6PDH、硝苯地平、氧化型銷(xiāo)苯地平購(gòu)于Sigma，尼群地平購(gòu)于中國(guó)藥品檢查所，甲醇、乙腈為色譜純，本試驗(yàn)所用的其它化學(xué)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。
2.2.3實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
3日齡二元雜交豬購(gòu)自華中農(nóng)業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)豬場(chǎng)；22日齡二元雜交豬購(gòu)自中糧集團(tuán)。
2.2.4試劑配制
0.5 mol/L EDTA： EDTA-NazIfcO 18.61 g, ddl^O 溶解，劇烈攪拌，加入 NaOH將pH調(diào)至8.0，定容至100 mL，高壓滅菌，冷卻后4°C保存。
電泳緩沖液(50XTAE)： Tris base 242 g,冰乙酸 57.1 mL，0.5 mol/L (pH8.0)EDTA 100 mL, ddHaO 溶解，定容至 1000 mL。
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第三章 IFN-γ對(duì)豬肝臟關(guān)鍵藥物代謝酶CYP3A29表達(dá)的影響 .............58-74 
3.1 前言..................... 58-59 
3.2 實(shí)驗(yàn)材料............... 59 
3.2.1 細(xì)胞系.................................. 59 
3.2.2 分子生物學(xué)相關(guān)試劑 ......................59 
3.3 實(shí)驗(yàn)方法 ....................59-63 
3.3.1 動(dòng)物試驗(yàn) .............................59 
3.3.2 細(xì)胞培養(yǎng)及基本指標(biāo)檢測(cè) .......................59 
3.3.3 IFN-γ對(duì)豬肝細(xì)胞的毒性試驗(yàn)(MTT法) .....................59-60 
3.3.4 RNA提取及濃度測(cè)定................ 60 
3.3.5 蛋白質(zhì)提取及濃度測(cè)定........................ 60 
3.3.6 豬肝微粒體CYP3A29代謝硝苯地平速率的測(cè)定...................... 60 
3.3.7 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)IFN-γ對(duì)CYP3A29和PXRmRNA表達(dá)的影響 .........60-62 
3.3.8 Western-bolt檢測(cè)IFN-γ對(duì)CYP3A29和PXR蛋白表達(dá)的影響................ 62 
3.3.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 ..................62-63 
3.4 結(jié)果與分析 ...................63-72 
3.4.1 MTT法測(cè)定IFN-γ對(duì)細(xì)胞的毒作用 .........................63 
3.4.2 實(shí)時(shí)熒光定量方法確立 ...............................63 
3.4.3 蛋白質(zhì)濃度測(cè)定 ........................63-65 
3.4.4 IFN-γ對(duì)豬原代肝細(xì)胞CYP3A29和PXR表達(dá)的影響 .............65-67 
3.4.5 IFN-γ對(duì)豬傳代肝細(xì)胞CYP3A29和PXR表達(dá)的影響 ....................67-70 
3.4.6 IFN-γ激活豬肝藥物代謝酶CYP3A29的表達(dá)、提高酶代謝活性............ 70-72 
3.5 討論 ...............................72-74 

第四章 IFN-α與IFN-γ對(duì)CYP3A29表達(dá)調(diào)控的分子機(jī)制

4.1前言
細(xì)胞色素P450是亞鐵血紅素-硫醇鹽蛋白（heme-thiolate proteins)的超家族的成員，它們?cè)诮^大多數(shù)的內(nèi)源性物質(zhì)的代謝中起到重要的作用，涉及內(nèi)源性和外源性物質(zhì)以及幾乎所有藥物和其衍生物的代謝。CYP3A4是人CYP450中最豐富和最重要的藥物代謝酶，可代謝超過(guò)50%臨床現(xiàn)存處方藥物。干擾素在臨床上被廣泛的用于抗病毒的治療，但是其如何調(diào)節(jié)P450酶的表達(dá)尚不清楚。因?yàn)槿梭w臨床研究的局限性，使得這方面的研究進(jìn)展的緩慢。豬的被認(rèn)為是研究藥物的吸收和代謝合適動(dòng)物模型，因此研究干擾素對(duì)豬CYP3A29表達(dá)調(diào)控的影響及其機(jī)制的調(diào)節(jié)，能為醫(yī)學(xué)臨床合理用藥提供理論依據(jù)。
近年來(lái)研究還表明，孕焼X受體（Pregnane X Receptor，PXR)是核受體超家族的重要一員，用配體——受體方式調(diào)節(jié)目的基因的轉(zhuǎn)錄（Guetal2006)，化學(xué)藥物調(diào)節(jié)P450酶表達(dá)變化通常依賴PXR介導(dǎo)說(shuō)我途徑（Shi etal 2010)。此外，進(jìn)來(lái)研究表明，一些生物藥物也能激活PXR,從而調(diào)節(jié)CYP3 A的表達(dá)（Yang etal 2010)。
基于以上所述，本人構(gòu)建了 CYP3A29及PXR真核表達(dá)載體的基礎(chǔ)上，擬以人最重要的藥物代謝酶CYP3A4的研究模型——豬CYP3A29為研究對(duì)象，擬通過(guò)體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)、肝臟原代細(xì)胞分離培養(yǎng)，從動(dòng)物活體水平及細(xì)胞水平，利用定量RT-PCR、Westem-blot方法，系統(tǒng)分析IFN-a、y對(duì)CYP3A29表達(dá)的影響；通過(guò)轉(zhuǎn)錄抑制、轉(zhuǎn)染、啟動(dòng)子報(bào)告基因等方法分析IFN對(duì)CYP3A29的轉(zhuǎn)錄調(diào)控；通過(guò)RNAi和基因轉(zhuǎn)染超表達(dá)方法研究孕燒X受體在CYP3A29表達(dá)調(diào)控中的作用。該研究將為生物藥物對(duì)CYP450表達(dá)調(diào)控研究提供理論依據(jù)，為獸醫(yī)及醫(yī)學(xué)臨床合理用藥提供理論指導(dǎo)，對(duì)提高藥物療效，降低毒副反應(yīng)和節(jié)約資金具有重要意義。
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總結(jié)

細(xì)胞色素P450酶（cytochrome P450，CYP450)是機(jī)體重要的藥物代謝酶，涉及內(nèi)源性和外源性物質(zhì)以及幾乎所有藥物和其衍生物的代謝。另一方面，內(nèi)源性、外源性化合物也能夠誘導(dǎo)或抑制CYP450的表達(dá)，而嚴(yán)重影響著藥物的代謝、療效和安全性。CYP3A29是豬體內(nèi)最重要最豐富的藥物代謝酶之一，是人重要藥物代謝酶CYP3A4的研究模型。干擾素（Interferon，IFN)作為新型生物藥物已被廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)臨床及獸醫(yī)臨床，使用過(guò)程中通常需要與其它藥物聯(lián)合應(yīng)用，以達(dá)到更好的效果，但其對(duì)機(jī)體藥物代謝酶的表達(dá)調(diào)控機(jī)制尚不清楚，由此導(dǎo)致的藥物代謝酶的表達(dá)及活性的變化嚴(yán)重影響著對(duì)藥物的代謝、療效和安全性，經(jīng)常導(dǎo)致藥效降低、產(chǎn)生毒副反應(yīng)及藥物殘留，給臨床合理用藥帶來(lái)了很大困難，既造成了藥物的浪費(fèi)，又嚴(yán)重影響人和動(dòng)物的健康。因此研究干擾素對(duì)豬CYP3A29表達(dá)調(diào)控的影響及其機(jī)制的調(diào)節(jié)，既能指導(dǎo)獸醫(yī)臨床用藥，又能為醫(yī)學(xué)臨床合理用藥提供理論依據(jù)。本研究從細(xì)胞水平及動(dòng)物活體水平研究了干擾素對(duì)CYP3A29表達(dá)的影響，并探討了其分子機(jī)制。

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本文編號(hào)：10860