發(fā)布時間：2014-12-25 09:48

 

【摘要】 細胞色素P450酶(cytochrome P450, CYP450)是機體重要的藥物代謝酶,涉及內源性和外源性物質以及幾乎所有藥物和其衍生物的代謝。另一方面,內源性、外源性化合物也能夠誘導或抑制CYP450的表達,而嚴重影響著藥物的代謝、療效和安全性。CYP3A29是豬體內最重要最豐富的藥物代謝酶之一,是人重要藥物代謝酶CYP3A4的研究模型。干擾素(Interferon, IFN)作為新型生物藥物已被廣泛應用于醫(yī)學臨床及獸醫(yī)臨床,使用過程中通常需要與其它藥物聯(lián)合應用,以達到更好的效果,但其對機體藥物代謝酶的表達調控機制尚不清楚,由此導致的藥物代謝酶的表達及活性的變化嚴重影響著對藥物的代謝、療效和安全性,經(jīng)常導致藥效降低、產(chǎn)生毒副反應及藥物殘留,給臨床合理用藥帶來了很大困難,既造成了藥物的浪費,又嚴重影響人和動物的健康。因此研究干擾素對豬CYP3A29表達調控的影響及其機制的調節(jié),既能指導獸醫(yī)臨床用藥,又能為醫(yī)學臨床合理用藥提供理論依據(jù)。本研究從細胞水平及動物活體水平研究了干擾素對CYP3A29表達的影響,并探討了其分子機制,取得的結果如下：1. IFN-a與IFN-y在細胞水平對CYP3A29表達的影響分離制備豬肝原代細胞,MTT還原法分別檢測IFN-a與IFN-y對豬肝細胞活性影響,證實IFN-a與IFN-y對其無細胞毒性作用；分別用不同劑量IFN-a與IFN-y在不同時間點處理豬原代肝細胞和傳代肝細胞HepLi,應用實時熒光定量PCR和Westen-blot檢測肝細胞的CYP3A29在mRNA水平和蛋白質的變化,結果表明IFN-a與IFN-y均能顯著上調CYP3A29表達,且具有一定的時間、劑量相關性。2. IFN-a與IFN-y在動物活體水平對CYP3A29表達及酶活性的影響分別用IFN-a與IFN-y肌肉注射30日齡仔豬,采用差速離法(Differential celltrifugation method)制備豬肝微粒體。應用實時熒光定量PCR和Westen-blot測定CYP3A29mRNA和蛋白質水平變化,結果表明IFN-a與IFN-y均能顯著上調CYP3A29表達,且與細胞水平相一致；以人CYP3A4的特異性底物硝苯地平作為探針,尼群地平作為內標,用高效液相色譜法測定硝苯地平氧化代謝產(chǎn)物氧化型硝苯地平含量,分析CYP3A29酶活性變化,表明豬CYP3A29基因與人CYP3A4基因致,具有硝苯地平氧化代謝活性,且IFN-a與IFN-y能激活CYP3A29酶代謝活性。3. IFN-a與IFN-y對孕烷受體PXR表達的影響分別用不同劑量IFN-a與IFN-y在不同時間點處理豬原代肝細胞和傳代肝細胞HepLi,應用實時熒光定量PCR和Westen-blot檢測PXR在mRNA水平和蛋白質的變化,結果表明IFN-α與IFN-γ均能顯著上調PXR表達,且與CYP3A29的表達具有一致性；動物實驗樣品熒光定量PCR和Westen-blot檢測結果與細胞水平檢測結果相一致。4. IFN-α與IFN-γ對CYP3A29表達調控機制分別構建PXR真核表達質粒pcDNA3.1-PXR及6個CYP3A29不同長度啟動子熒光素酶報告質粒；在MTT還原法檢測轉錄抑制劑DRB對豬肝細胞無細胞毒性作用基礎上,通過轉錄抑制試驗確定肝臟藥物代謝酶CYP3A29的啟動子在IFN-α與IFN-γ調控中的作用,采用細胞轉染PXR真核表達質粒和siPXR使核受體PXR超表達或者沉默,轉染不同長度的CYP3A29啟動子片段,探討IFN-α與IFN-γ上調CYP3A29表達的分子機制。實驗結果表明：(1) IFN-α與IFN-γ通過激活CYP3A29啟動子上調CYP3A29的表達,IFN-α與IFN-γ激活CYP3A29轉錄部位是位于轉錄起始上游-1473至-1021區(qū)域；(2) IFN-α與IFN-γ處理細胞后,PXR mRNA上調先于CYP3A29mRNA發(fā)生,推斷PXR作為轉錄因子參與激活CYP3A29表達；(3)PXR超表達試驗和RNA干擾試驗表明IFN-α與IFN-γ激活CYP3A29的表達與核受體PXR相關。

第一章文獻綜述

1.1 干擾素（Interferon，IFN)
干擾素（Interferon，IFN)是由細胞基因控制、在特定誘導劑的作用下產(chǎn)生的一類細胞因子，具有廣譜抗病毒、抗腫瘤和免疫調節(jié)等多種生物活性。隨著基因工程技術的發(fā)展，干擾素生物學活性、產(chǎn)生及其作用機理得到了闡明，為其臨床應用提供了理論依據(jù)。目前作為新型生物藥物，干擾素已被廣泛應用于醫(yī)學臨床病毒性疾病及腫瘤的治療，筆耕文化推薦期刊，在獸醫(yī)臨床中被廣泛用于病毒性疾病的預防和治療（陳雪2006;張真2007;張海玲和聞喜軍2008)。
上個世紀80年代美國國家過敏癥與傳染病研究所和世界衛(wèi)生組織根據(jù)抗原的特異性，把干擾素分為三類：IFN-a、IFN-p和IFN-y。后來，又根據(jù)干擾素共同享用受體的不同被分為I型、II型和III型干擾素。I型包括IFN-a、IFN-P、IFN-O)和IFN-x, II 型包括 IFN-y (Jonasch and Haluska 2001 )； III 型指 IFN-?o。幾乎所有類型細胞都可以分泌I型干擾素，具有代表性的是白細胞和成纖維細胞分泌的IFN-a和IFN-P，而IFN-y由T-細胞和自然殺傷細胞（NK)分泌，IFN-X主要在對病毒的自然免疫中在肝細胞、單核細胞等為數(shù)不多的幾種細胞中有分泌（Sheppardetal2003)。
干擾素基因基本上都是由四部分組成：5’非編碼區(qū)、成熟肽編碼區(qū)、信號肽編碼區(qū)和3’非編碼區(qū)。5’非編碼區(qū)具有一定的保守區(qū)域，它對干擾素基因轉錄的起始調控和識別具有重要的作用，一些保守區(qū)的序列可能與病毒誘生有關。信號肽在不同的干擾素中數(shù)目也不相同，信號肽指導干擾素前體運輸?shù)郊毎ぃ缓蟊磺谐�，使成熟的干擾素分泌到細胞外。不同干擾素的氨基酸數(shù)目、組成種類各不相同，其結構也各有差異（胡慧珍和思汗2009)。
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1.2 細胞色素 P450 (cytochrome P450, CYP450)
細胞色素P450是亞鐵血紅素-硫醇鹽蛋白（heme-thiolate proteins)的超家族的成員，它們在絕大多數(shù)的內源性物質的代謝中起到重要的作用，如氧化作用、超氧化作用及還原作用等；這些內源性物質包括：脂肪酸、類固醇激素、前列腺素、膽汁酸以及脂溶性的維生素等。細胞色素P450對保持多種化合物在不同的細胞過程中的平衡起到重要的維護作用。此外，細胞色素P450中很多酶對外源性物質如藥物、致癌物質以及環(huán)境污染物的代謝起到重要作用，這些外源性物質在P450酶的作用下，通過I相代謝作用，使親脂性的物質轉化成水溶性物質以利于排除體外(Goodwin et al 2002)。細胞色素P450受到了研究者的廣泛關注，截止到2013年底，大約有6.9萬篇關于細胞色素P450的研究報道（Renault etal 2014)，最初的報道主要見于細胞色素P450在哺乳動物中與代謝有關的醫(yī)學和藥理學研究，現(xiàn)在植物、微生物領域都有相關研究報道。
1.2.1細胞色素P450的發(fā)現(xiàn)與分布
1958年，Klingberg和Grfinkle分別在大鼠和豬上發(fā)現(xiàn)一種膜結合的微粒體蛋白組分，它與一氧化碳結合后在450nm處有一明顯的吸收峰，隨后這種蛋白被證實為細胞色素P450。由于其獨特的在光譜450nm處有吸收峰，因此被命名為P450。
細胞色素P450分布十分廣泛，在動物、植物、微生物中均已發(fā)現(xiàn)它的存在。在脊椎動物中，細胞色素P450含量最豐富的器官是肝臟，這與其功能相適應，其次是小腸。在其他器官或組織中也均有分布，如：腎臟、肺、胎盤、皮膚、腎上腺、睪丸、大腦以及主動脈等（任彭和劉兆平2006)。
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第二章IFN-a對豬肝臟關鍵藥物代謝酶CYP3A29表達的影響

2.1前言
干擾素（Interferon，IFN)是由細胞基因控制、在特定誘導劑的作用下產(chǎn)生的一類細胞因子，具有廣譜抗病毒、抗腫瘤和免疫調節(jié)等多種生物活性。根據(jù)干擾素共同享用受體的不同被分為I型、n型和III型干擾素，IFN-a屬于I型干擾素，有強大的抗病毒作用。隨著基因工程技術的發(fā)展，IFN生物學活性、產(chǎn)生及其作用機理得到了闡明，為其臨床應用提供了理論依據(jù)。目前作為新型生物藥物，IFN已被廣泛應用于醫(yī)學臨床病毒性疾病及腫瘤的治療（Campbell et al 1999； Yoshiji et al 2005；Radaeva et al 2002；劉金旭和陳文梅2010)。并且在獸醫(yī)臨床中被應用于病毒性疾病的預防和治療（陳雪2006;張真2007;張海玲和閆喜軍2008)。盡管如此，對于IFN仍有許多問題亟待解決。尤其是在臨床上，IFN經(jīng)常需要與其它藥物聯(lián)合應用，以達到更好的效果。但是IFN對機體藥物代謝酶的表達調控及分子機制尚不清楚，由此導致的藥物代謝酶的表達及活性的變化嚴重影響著對藥物的代謝、療效和安全性，經(jīng)常導致藥效降低或產(chǎn)生毒副反應，給臨床合理用藥帶來了很大困難，既造成了藥物的巨大浪費，又嚴重影響著人和動物的健康。
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2.2實驗材料
2.2.1細胞系
傳代肝細胞系HepLi由浙江大學醫(yī)學院李蘭娟教授饋贈。
2.2.2分子生物學相關試劑
rTaq DNA 聚合酶（Takara)，RNA 提取試劑 RNAiso Plus Reagent (TaKaRa),PrimeScript反轉錄酶(TaKaRa),熒光定量試劑(Bio-Rad)，青鏈毒素溶液(Hyclone),DL2000(東盛)，DL15000(東盛)，dNTP(TaKaRa),細胞裂解緩沖液 RIPA Buffer(Pierce),蛋白酶抑制劑（Pierce)，蛋白酶 K (sigma), IFN-a 購自 Kingfisher 公司，CYP3A29 抗體、P-actin 抗體、PXR 抗體購自 Santa Cruz Biotechnology 公司，羊抗鼠_標二抗購自武漢三鷹公司，DMEM高糖培養(yǎng)基、DPBS緩沖液、OPTI-MEM、胎牛血清購自美國GIBCO公司，P-NADP、G6PDH、硝苯地平、氧化型銷苯地平購于Sigma，尼群地平購于中國藥品檢查所，甲醇、乙腈為色譜純，本試驗所用的其它化學試劑均為國產(chǎn)分析純。
2.2.3實驗動物
3日齡二元雜交豬購自華中農(nóng)業(yè)大學實驗豬場；22日齡二元雜交豬購自中糧集團。
2.2.4試劑配制
0.5 mol/L EDTA： EDTA-NazIfcO 18.61 g, ddl^O 溶解，劇烈攪拌，加入 NaOH將pH調至8.0，定容至100 mL，高壓滅菌，冷卻后4°C保存。
電泳緩沖液(50XTAE)： Tris base 242 g,冰乙酸 57.1 mL，0.5 mol/L (pH8.0)EDTA 100 mL, ddHaO 溶解，定容至 1000 mL。
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第三章 IFN-γ對豬肝臟關鍵藥物代謝酶CYP3A29表達的影響 .............58-74 
3.1 前言..................... 58-59 
3.2 實驗材料............... 59 
3.2.1 細胞系.................................. 59 
3.2.2 分子生物學相關試劑 ......................59 
3.3 實驗方法 ....................59-63 
3.3.1 動物試驗 .............................59 
3.3.2 細胞培養(yǎng)及基本指標檢測 .......................59 
3.3.3 IFN-γ對豬肝細胞的毒性試驗(MTT法) .....................59-60 
3.3.4 RNA提取及濃度測定................ 60 
3.3.5 蛋白質提取及濃度測定........................ 60 
3.3.6 豬肝微粒體CYP3A29代謝硝苯地平速率的測定...................... 60 
3.3.7 實時熒光定量PCR檢測IFN-γ對CYP3A29和PXRmRNA表達的影響 .........60-62 
3.3.8 Western-bolt檢測IFN-γ對CYP3A29和PXR蛋白表達的影響................ 62 
3.3.9 統(tǒng)計學方法 ..................62-63 
3.4 結果與分析 ...................63-72 
3.4.1 MTT法測定IFN-γ對細胞的毒作用 .........................63 
3.4.2 實時熒光定量方法確立 ...............................63 
3.4.3 蛋白質濃度測定 ........................63-65 
3.4.4 IFN-γ對豬原代肝細胞CYP3A29和PXR表達的影響 .............65-67 
3.4.5 IFN-γ對豬傳代肝細胞CYP3A29和PXR表達的影響 ....................67-70 
3.4.6 IFN-γ激活豬肝藥物代謝酶CYP3A29的表達、提高酶代謝活性............ 70-72 
3.5 討論 ...............................72-74 

第四章 IFN-α與IFN-γ對CYP3A29表達調控的分子機制

4.1前言
細胞色素P450是亞鐵血紅素-硫醇鹽蛋白（heme-thiolate proteins)的超家族的成員，它們在絕大多數(shù)的內源性物質的代謝中起到重要的作用，涉及內源性和外源性物質以及幾乎所有藥物和其衍生物的代謝。CYP3A4是人CYP450中最豐富和最重要的藥物代謝酶，可代謝超過50%臨床現(xiàn)存處方藥物。干擾素在臨床上被廣泛的用于抗病毒的治療，但是其如何調節(jié)P450酶的表達尚不清楚。因為人體臨床研究的局限性，使得這方面的研究進展的緩慢。豬的被認為是研究藥物的吸收和代謝合適動物模型，因此研究干擾素對豬CYP3A29表達調控的影響及其機制的調節(jié)，能為醫(yī)學臨床合理用藥提供理論依據(jù)。
近年來研究還表明，孕焼X受體（Pregnane X Receptor，PXR)是核受體超家族的重要一員，用配體——受體方式調節(jié)目的基因的轉錄（Guetal2006)，化學藥物調節(jié)P450酶表達變化通常依賴PXR介導說我途徑（Shi etal 2010)。此外，進來研究表明，一些生物藥物也能激活PXR,從而調節(jié)CYP3 A的表達（Yang etal 2010)。
基于以上所述，本人構建了 CYP3A29及PXR真核表達載體的基礎上，擬以人最重要的藥物代謝酶CYP3A4的研究模型——豬CYP3A29為研究對象，擬通過體內動物實驗、肝臟原代細胞分離培養(yǎng)，從動物活體水平及細胞水平，利用定量RT-PCR、Westem-blot方法，系統(tǒng)分析IFN-a、y對CYP3A29表達的影響；通過轉錄抑制、轉染、啟動子報告基因等方法分析IFN對CYP3A29的轉錄調控；通過RNAi和基因轉染超表達方法研究孕燒X受體在CYP3A29表達調控中的作用。該研究將為生物藥物對CYP450表達調控研究提供理論依據(jù)，為獸醫(yī)及醫(yī)學臨床合理用藥提供理論指導，對提高藥物療效，降低毒副反應和節(jié)約資金具有重要意義。
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總結

細胞色素P450酶（cytochrome P450，CYP450)是機體重要的藥物代謝酶，涉及內源性和外源性物質以及幾乎所有藥物和其衍生物的代謝。另一方面，內源性、外源性化合物也能夠誘導或抑制CYP450的表達，而嚴重影響著藥物的代謝、療效和安全性。CYP3A29是豬體內最重要最豐富的藥物代謝酶之一，是人重要藥物代謝酶CYP3A4的研究模型。干擾素（Interferon，IFN)作為新型生物藥物已被廣泛應用于醫(yī)學臨床及獸醫(yī)臨床，使用過程中通常需要與其它藥物聯(lián)合應用，以達到更好的效果，但其對機體藥物代謝酶的表達調控機制尚不清楚，由此導致的藥物代謝酶的表達及活性的變化嚴重影響著對藥物的代謝、療效和安全性，經(jīng)常導致藥效降低、產(chǎn)生毒副反應及藥物殘留，給臨床合理用藥帶來了很大困難，既造成了藥物的浪費，又嚴重影響人和動物的健康。因此研究干擾素對豬CYP3A29表達調控的影響及其機制的調節(jié)，既能指導獸醫(yī)臨床用藥，又能為醫(yī)學臨床合理用藥提供理論依據(jù)。本研究從細胞水平及動物活體水平研究了干擾素對CYP3A29表達的影響，并探討了其分子機制。

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 參考文獻:

[1] 梁海偉,郭宣麟.  孕烷X受體的研究進展[J]. 生物技術通訊. 2013(03)
[2] 王天曉.  孕烷X受體與腫瘤多藥耐藥[J]. 國際藥學研究雜志. 2010(05)
[3] 劉金旭,陳文梅.  臨床應用干擾素的不良反應[J]. 基層醫(yī)學論壇. 2010(22)
[4] 陳欣,李玉珍,方翼.  CYP3A4代謝藥物的特點及其多態(tài)性的研究現(xiàn)狀[J]. 中國藥房. 2010(22)
[5] 胡慧珍,思汗.  干擾素的研究進展[J]. 當代畜禽養(yǎng)殖業(yè). 2009(12)
[6] 楊霞.  干擾素基因的研究及在豬抗病育種中的應用[J]. 飼料博覽. 2009(03)
[7] 許景峰,楊凡.  藥物代謝酶CYP2C9基因的研究進展[J]. 中國新藥雜志. 2008(14)
[8] 張海玲,閆喜軍.  干擾素研究進展[J]. 動物醫(yī)學進展. 2008(04)
[9] 張真.  使用豬白細胞干擾素對豬鏈球菌、副豬嗜血桿菌、圓環(huán)病毒混合感染的治療報告[J]. 中國畜牧獸醫(yī). 2007(03)
[10] 陳雪.  規(guī)�；i場主要傳染病的藥物治療與藥物預防[J]. 中國動物檢疫. 2006(12)

 

 


本文編號：10860