生物素作為抗癌藥物靶向配體的研討進(jìn)展
發(fā)布時(shí)間：2014-11-13 21:38
第 1 章 緒 論
近年來藥物載體成為研究最熱門的范疇之一[1,2]，其緣故原由不但是由于它有利于藥物療效的進(jìn)步，毒副作用的低落，更重要的是由于它可以到達(dá)某種緩控釋的結(jié)果，從而減輕病人多次用藥的痛楚。在藥物緩控釋的體系中，除了藥物所發(fā)揮的作用外，藥物載體質(zhì)料也飾演著舉足輕重的腳色�，F(xiàn)在，藥物載體質(zhì)料重要是高分子質(zhì)料，包羅自然高分子質(zhì)料和合成的高分子質(zhì)料。此中自然高分子質(zhì)料因其自身的可降解性、精良的生物相容性以及可從體內(nèi)寧靜消除等特性受到研究者們的青睞。自然高分子質(zhì)料重要有卵白、多肽和多糖類，而多糖類作為藥物載體的研究不停備受存眷[3,4]。
作為一種天然來源的生物材料，多糖來源廣泛、廉價(jià)易得、結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、安全無毒、具有親水性、可降解性等特點(diǎn)，尤其是大部分多糖含有親水性基團(tuán)可以和生物組織非共價(jià)結(jié)合，因而可以延長藥物在體內(nèi)的滯留時(shí)間從而增加藥物吸收。更重要的一點(diǎn)是，多糖類結(jié)構(gòu)中富含羧基（-COOH）、羥基（-OH）以及氨基（-NH2）等親水性基團(tuán)，很容易連接上不同的基團(tuán)使其性質(zhì)和作用發(fā)生巨大變化，生成具有生物活性的衍生物。例如：接枝上疏水性的基團(tuán)可以改善其親水性的特性使其具有兩親性[5]，接枝上聚合物長鏈延長體內(nèi)循環(huán)時(shí)間[6]，接枝上靶向配體則使得該材料具備組織靶向性[7]，多糖的所有這些優(yōu)點(diǎn)被學(xué)者們廣泛應(yīng)用于藥物載體材料的研究。
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1.1 普魯蘭糖簡介
普魯蘭糖（Pullulan），作為多糖的一種，是出芽孢梗霉孕育發(fā)生的胞外多糖，以 α-1,4糖苷鍵聯(lián)合的麥芽三糖，兩頭再以 α-1,6 糖苷鍵同別的的麥芽三糖重復(fù)毗連而成的高分子線性多糖[8]，布局式見圖 1-1。普魯蘭糖無色、無味、富含羥基，極易溶于水和 DMSO，不溶于常見醇類、丙酮、醚和氯仿等有機(jī)溶劑。普魯蘭糖寧靜無毒、無免疫原性，無致畸作用，具有精良生物相容性、可生物降解性等諸多長處，被視作為一種精良的生物質(zhì)料運(yùn)用在藥物傳送體系和構(gòu)造工程等范疇[9-11]。
由于普魯蘭多糖分子上有大量的羥基，因此性質(zhì)比較活潑，可以進(jìn)行多種化學(xué)修飾。例如，可以通過酯化、羧甲基化[12,13]、乙�；痆14]等多種反應(yīng)將疏水性的側(cè)鏈接枝到主鏈上，形成部分疏水改性的普魯蘭糖。
目前，對于普魯蘭糖疏水改性后作為藥物載體材料的報(bào)道屢見不鮮[15,16]。其中，膽固醇，這個(gè)疏水性物質(zhì)作為內(nèi)源小分子接枝到普魯蘭糖鏈上，使之獲得具有兩親性質(zhì)的膽甾醇基普魯蘭糖（CHP）材料的相關(guān)研究亦是層出不窮[17,18]。由于普魯蘭糖水溶性極好，而接枝上膽甾醇后能夠在水中自組裝成 CHP 凝膠納米粒，這一現(xiàn)象引發(fā)了眾多學(xué)者的極大熱情。Akiyoshi[19]等用 1,6-己二異氰酸酯為連接臂，將膽甾醇鍵合到不同分子量普魯蘭糖鏈上，獲得系列不同取代度的膽甾醇基普魯蘭糖（CHP）；Yang[20]等選用三羧酸循環(huán)的中間產(chǎn)物-琥珀酸這個(gè)內(nèi)源性物質(zhì)作為普魯蘭糖疏水改性的連接臂，合成了膽甾醇基普魯蘭糖（CHSP），其用作藥物載體，理論上更具安全性。因而，膽甾醇基普魯蘭糖衍生物在醫(yī)藥領(lǐng)域中的應(yīng)用日益受到研究者們的重視。
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第 2 章 生物素化膽甾醇基普魯蘭糖（Bio-CHSP）材料合成、表征及其自聚集納米粒的制備
2.1 引言
普魯蘭糖（Pullulan）是出芽短梗霉發(fā)酵產(chǎn)生的胞外多糖，由于其安全無毒、無免疫原性、易生物降解，多羥基易化學(xué)改性等眾多特性，近年來在藥物載體方面受到眾多學(xué)者的關(guān)注。其中，Yang[20]等人通過對其化學(xué)改性制成膽甾醇基普魯蘭糖（CHSP），該材料由于具有兩親性，能夠在水中自聚集成為納米粒，有望成為生物醫(yī)藥載體。
本章中在此研究基礎(chǔ)上，對該材料進(jìn)一步化學(xué)修飾，通過酯化作用合成不同生物素取代度的生物素化膽甾醇基普魯蘭糖 Bio-CHSP-20.1、Bio-CHSP-29.2、Bio-CHSP-38.9，并通過紅外光譜（FT-IR）、核磁共振氫譜（1H-NMR）以及 X 射線粉末衍射（XRD）對 Bio-CHSP進(jìn)行結(jié)構(gòu)表征。同時(shí)考察了 Bio-CHSP-20.1、Bio-CHSP-29.2、Bio-CHSP-38.9在水中的自聚集行為，并對納米粒的形態(tài)、粒徑分布和 Zeta 電位進(jìn)行了研究和表征，為下一章包載疏水性抗癌藥物打下基礎(chǔ)。
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2.2 試劑及儀器
2.2.1 材料及試劑
普魯蘭多糖（Mw:200 000，日本林原化學(xué)株式會(huì)社）；4-二甲氨基吡啶（DMAP，Aldrich 公司）；1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳酰二亞胺鹽酸鹽（EDC，上海共價(jià)化學(xué)科技有限公司）；N-羥基琥珀酰亞胺（NHS，Sigma 公司）；琥珀酸酐（天津市福晨化學(xué)試劑廠）；膽甾醇（分析純，北京鼎國生物技術(shù)有限責(zé)任公司）；生物素（國藥集團(tuán)上海化學(xué)試劑有限公司）；透析袋（Mw 8-14 KDa，北京新澤科技有限公司）；無水乙醇、二甲亞砜（DMSO）、四氫呋喃（THF）、無水吡啶等均購于天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；其余試劑均為國產(chǎn)分析純。
............................
第3章 載藥 Bio-CHSP 納米粒的制備、表征及體外釋放............... 26-35
3.1 引言 ...................26
3.2 試劑及儀器 ...........................26
3.2.1 材料及試劑 ......................26
3.2.2 儀器設(shè)備......................... 26
3.3 實(shí)驗(yàn)方法 ..................................26-28
3.3.1 載藥米托蒽醌納米粒（MTO/Bio-CHSP）的制備.............. 26-27
3.3.2 載藥納米粒包封率（LE%）與載藥量（LC%）的測定...................... 27
3.3.3 載藥 Bio-CHSP 自聚集納米粒的透射電鏡表征..................... 27
3.3.4 載藥 Bio-CHSP 自聚集納米粒粒徑分布及 Zeta 電位的測定.............. 27
3.3.5 載藥 Bio-CHSP 自聚集納米粒 XRD 粉末衍射分析........................ 27
3.3.6 載藥 Bio-CHSP 自聚集納米粒的體外釋放 .................27-28
3.4 結(jié)果與討論 ..........................28-34
3.4.1 MTO 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立.................. 28-29
3.4.2 載藥納米粒的制備.................. 29-30
3.4.3 MTO 在 Bio-CHSP 中的存在形式及載藥納米粒的表征........... 30-32
3.4.4 載藥納米粒體外釋放實(shí)驗(yàn) ...............32-34
3.5 結(jié)論............................ 34-35
第4章 Bio-CHSP 納米粒小鼠體內(nèi)安全性的初步評價(jià)
4.1 引言
接納生物相容性納米載體質(zhì)料負(fù)載藥物表現(xiàn)出很多長處，但邇來研究表現(xiàn)，應(yīng)用納米質(zhì)料也具有潛伏毒性，比方：肺毒性、皮膚毒性、載藥后引發(fā)的細(xì)胞毒性和遺傳毒性等日漸受到研究者存眷[85-87]。故觀察納米載體質(zhì)料的生物寧靜性尤為緊張。以毒理學(xué)研究為底子的納米寧靜性評價(jià)報(bào)道日益增多[88-91]。文獻(xiàn)報(bào)道[91]小鼠尾靜脈注射 200 mg/kg乙酰普魯蘭糖納米粒溶液，急毒實(shí)行表現(xiàn)，實(shí)行組小鼠體重和食量與比較組相比未見非常，試驗(yàn)時(shí)期未見動(dòng)物去世亡，小鼠各臟器的構(gòu)造切片亦無病理變革，由此得出，乙酰普魯蘭糖作為納米載體質(zhì)料，具備開端生物寧靜性。
本部分將 Bio-CHSP NPs 納米溶液，經(jīng)尾靜脈注射于小鼠體內(nèi)，觀察動(dòng)物的體征、體重、食量及主要臟器病理切片，驗(yàn)證 Bio-CHSP 材料初步生物安全性。
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總結(jié)
膽甾化的普魯蘭糖（CHSP）具有良好的生物相容性，由于其具有兩親性，在水中可以通過疏水作用自聚集形成納米粒，是疏水性藥物尤其是抗腫瘤藥物的優(yōu)良載體。為設(shè)計(jì)其為靶向載體，通過酯化反應(yīng)，在 CHSP 材料上連接生物素靶頭，合成不同取代度的生物素化膽甾醇基普魯蘭糖（Bio-CHSP），并對其進(jìn)行表征。采用新型 Bio-CHSP 材料自聚集納米粒負(fù)載抗癌藥物米托蒽醌，考察其體外釋放；小鼠尾靜脈注射 Bio-CHSP納米溶液，初步評價(jià) Bio-CHSP 材料的生物安全性。全文總結(jié)如下：
1. 采用酯化反應(yīng)，將生物素化學(xué)鍵合到膽甾醇基普魯蘭糖分子鏈上，經(jīng) FT-IR、1H-NMR、 XRD 表征證明，成功合成不同取代度的生素素化膽甾醇基普魯蘭糖（Bio-CHSP），1H-NMR 法測定生物素取代度；透析法制備其自聚集納米粒，經(jīng)熒光光譜、透射電鏡及動(dòng)態(tài)光散射檢測，該材料可自聚集成粒徑均勻的 100~180 nm球形納米粒；穩(wěn)態(tài)熒光法測得臨界聚集濃度，其與生物素取代度具有負(fù)相關(guān)性。
2. 米托蒽醌（MTO）為模型藥物，制備表征負(fù)載 MTO 的 Bio-CHSP 材料納米粒。結(jié)果表明：MTO/Bio-CHSPNPs 包封率均超過 80%，粒徑均勻，載藥納米粒體外釋放，呈現(xiàn)雙相釋放，明顯延緩 MTO 的體外釋放，故 Bio-CHSP 可用作抗癌藥物的緩釋載體。
3. 通過尾靜脈注射 Bio-CHSP 納米粒溶液，對比小鼠的生長、食量及切片，綜合評價(jià) Bio-CHSP 材料的動(dòng)物體內(nèi)安全性。實(shí)驗(yàn)顯示：實(shí)驗(yàn)組與對照組沒有顯著差異，在 200mg/kg 小鼠尾靜脈注射 Bio-CHSP 納米溶液，未見明顯毒性。故初步證明 Bio-CHSP 材料具備一定生物安全性，為下一步的實(shí)驗(yàn)細(xì)胞及腫瘤靶向?qū)嶒?yàn)奠定基礎(chǔ)。
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參考文獻(xiàn)（略）
本文編號：10073
近年來藥物載體成為研究最熱門的范疇之一[1,2]，其緣故原由不但是由于它有利于藥物療效的進(jìn)步，毒副作用的低落，更重要的是由于它可以到達(dá)某種緩控釋的結(jié)果，從而減輕病人多次用藥的痛楚。在藥物緩控釋的體系中，除了藥物所發(fā)揮的作用外，藥物載體質(zhì)料也飾演著舉足輕重的腳色�，F(xiàn)在，藥物載體質(zhì)料重要是高分子質(zhì)料，包羅自然高分子質(zhì)料和合成的高分子質(zhì)料。此中自然高分子質(zhì)料因其自身的可降解性、精良的生物相容性以及可從體內(nèi)寧靜消除等特性受到研究者們的青睞。自然高分子質(zhì)料重要有卵白、多肽和多糖類，而多糖類作為藥物載體的研究不停備受存眷[3,4]。
作為一種天然來源的生物材料，多糖來源廣泛、廉價(jià)易得、結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、安全無毒、具有親水性、可降解性等特點(diǎn)，尤其是大部分多糖含有親水性基團(tuán)可以和生物組織非共價(jià)結(jié)合，因而可以延長藥物在體內(nèi)的滯留時(shí)間從而增加藥物吸收。更重要的一點(diǎn)是，多糖類結(jié)構(gòu)中富含羧基（-COOH）、羥基（-OH）以及氨基（-NH2）等親水性基團(tuán)，很容易連接上不同的基團(tuán)使其性質(zhì)和作用發(fā)生巨大變化，生成具有生物活性的衍生物。例如：接枝上疏水性的基團(tuán)可以改善其親水性的特性使其具有兩親性[5]，接枝上聚合物長鏈延長體內(nèi)循環(huán)時(shí)間[6]，接枝上靶向配體則使得該材料具備組織靶向性[7]，多糖的所有這些優(yōu)點(diǎn)被學(xué)者們廣泛應(yīng)用于藥物載體材料的研究。
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1.1 普魯蘭糖簡介
普魯蘭糖（Pullulan），作為多糖的一種，是出芽孢梗霉孕育發(fā)生的胞外多糖，以 α-1,4糖苷鍵聯(lián)合的麥芽三糖，兩頭再以 α-1,6 糖苷鍵同別的的麥芽三糖重復(fù)毗連而成的高分子線性多糖[8]，布局式見圖 1-1。普魯蘭糖無色、無味、富含羥基，極易溶于水和 DMSO，不溶于常見醇類、丙酮、醚和氯仿等有機(jī)溶劑。普魯蘭糖寧靜無毒、無免疫原性，無致畸作用，具有精良生物相容性、可生物降解性等諸多長處，被視作為一種精良的生物質(zhì)料運(yùn)用在藥物傳送體系和構(gòu)造工程等范疇[9-11]。
由于普魯蘭多糖分子上有大量的羥基，因此性質(zhì)比較活潑，可以進(jìn)行多種化學(xué)修飾。例如，可以通過酯化、羧甲基化[12,13]、乙�；痆14]等多種反應(yīng)將疏水性的側(cè)鏈接枝到主鏈上，形成部分疏水改性的普魯蘭糖。
目前，對于普魯蘭糖疏水改性后作為藥物載體材料的報(bào)道屢見不鮮[15,16]。其中，膽固醇，這個(gè)疏水性物質(zhì)作為內(nèi)源小分子接枝到普魯蘭糖鏈上，使之獲得具有兩親性質(zhì)的膽甾醇基普魯蘭糖（CHP）材料的相關(guān)研究亦是層出不窮[17,18]。由于普魯蘭糖水溶性極好，而接枝上膽甾醇后能夠在水中自組裝成 CHP 凝膠納米粒，這一現(xiàn)象引發(fā)了眾多學(xué)者的極大熱情。Akiyoshi[19]等用 1,6-己二異氰酸酯為連接臂，將膽甾醇鍵合到不同分子量普魯蘭糖鏈上，獲得系列不同取代度的膽甾醇基普魯蘭糖（CHP）；Yang[20]等選用三羧酸循環(huán)的中間產(chǎn)物-琥珀酸這個(gè)內(nèi)源性物質(zhì)作為普魯蘭糖疏水改性的連接臂，合成了膽甾醇基普魯蘭糖（CHSP），其用作藥物載體，理論上更具安全性。因而，膽甾醇基普魯蘭糖衍生物在醫(yī)藥領(lǐng)域中的應(yīng)用日益受到研究者們的重視。
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第 2 章 生物素化膽甾醇基普魯蘭糖（Bio-CHSP）材料合成、表征及其自聚集納米粒的制備
2.1 引言
普魯蘭糖（Pullulan）是出芽短梗霉發(fā)酵產(chǎn)生的胞外多糖，由于其安全無毒、無免疫原性、易生物降解，多羥基易化學(xué)改性等眾多特性，近年來在藥物載體方面受到眾多學(xué)者的關(guān)注。其中，Yang[20]等人通過對其化學(xué)改性制成膽甾醇基普魯蘭糖（CHSP），該材料由于具有兩親性，能夠在水中自聚集成為納米粒，有望成為生物醫(yī)藥載體。
本章中在此研究基礎(chǔ)上，對該材料進(jìn)一步化學(xué)修飾，通過酯化作用合成不同生物素取代度的生物素化膽甾醇基普魯蘭糖 Bio-CHSP-20.1、Bio-CHSP-29.2、Bio-CHSP-38.9，并通過紅外光譜（FT-IR）、核磁共振氫譜（1H-NMR）以及 X 射線粉末衍射（XRD）對 Bio-CHSP進(jìn)行結(jié)構(gòu)表征。同時(shí)考察了 Bio-CHSP-20.1、Bio-CHSP-29.2、Bio-CHSP-38.9在水中的自聚集行為，并對納米粒的形態(tài)、粒徑分布和 Zeta 電位進(jìn)行了研究和表征，為下一章包載疏水性抗癌藥物打下基礎(chǔ)。
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2.2 試劑及儀器
2.2.1 材料及試劑
普魯蘭多糖（Mw:200 000，日本林原化學(xué)株式會(huì)社）；4-二甲氨基吡啶（DMAP，Aldrich 公司）；1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳酰二亞胺鹽酸鹽（EDC，上海共價(jià)化學(xué)科技有限公司）；N-羥基琥珀酰亞胺（NHS，Sigma 公司）；琥珀酸酐（天津市福晨化學(xué)試劑廠）；膽甾醇（分析純，北京鼎國生物技術(shù)有限責(zé)任公司）；生物素（國藥集團(tuán)上海化學(xué)試劑有限公司）；透析袋（Mw 8-14 KDa，北京新澤科技有限公司）；無水乙醇、二甲亞砜（DMSO）、四氫呋喃（THF）、無水吡啶等均購于天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；其余試劑均為國產(chǎn)分析純。
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第3章 載藥 Bio-CHSP 納米粒的制備、表征及體外釋放............... 26-35
3.1 引言 ...................26
3.2 試劑及儀器 ...........................26
3.2.1 材料及試劑 ......................26
3.2.2 儀器設(shè)備......................... 26
3.3 實(shí)驗(yàn)方法 ..................................26-28
3.3.1 載藥米托蒽醌納米粒（MTO/Bio-CHSP）的制備.............. 26-27
3.3.2 載藥納米粒包封率（LE%）與載藥量（LC%）的測定...................... 27
3.3.3 載藥 Bio-CHSP 自聚集納米粒的透射電鏡表征..................... 27
3.3.4 載藥 Bio-CHSP 自聚集納米粒粒徑分布及 Zeta 電位的測定.............. 27
3.3.5 載藥 Bio-CHSP 自聚集納米粒 XRD 粉末衍射分析........................ 27
3.3.6 載藥 Bio-CHSP 自聚集納米粒的體外釋放 .................27-28
3.4 結(jié)果與討論 ..........................28-34
3.4.1 MTO 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立.................. 28-29
3.4.2 載藥納米粒的制備.................. 29-30
3.4.3 MTO 在 Bio-CHSP 中的存在形式及載藥納米粒的表征........... 30-32
3.4.4 載藥納米粒體外釋放實(shí)驗(yàn) ...............32-34
3.5 結(jié)論............................ 34-35
第4章 Bio-CHSP 納米粒小鼠體內(nèi)安全性的初步評價(jià)
4.1 引言
接納生物相容性納米載體質(zhì)料負(fù)載藥物表現(xiàn)出很多長處，但邇來研究表現(xiàn)，應(yīng)用納米質(zhì)料也具有潛伏毒性，比方：肺毒性、皮膚毒性、載藥后引發(fā)的細(xì)胞毒性和遺傳毒性等日漸受到研究者存眷[85-87]。故觀察納米載體質(zhì)料的生物寧靜性尤為緊張。以毒理學(xué)研究為底子的納米寧靜性評價(jià)報(bào)道日益增多[88-91]。文獻(xiàn)報(bào)道[91]小鼠尾靜脈注射 200 mg/kg乙酰普魯蘭糖納米粒溶液，急毒實(shí)行表現(xiàn)，實(shí)行組小鼠體重和食量與比較組相比未見非常，試驗(yàn)時(shí)期未見動(dòng)物去世亡，小鼠各臟器的構(gòu)造切片亦無病理變革，由此得出，乙酰普魯蘭糖作為納米載體質(zhì)料，具備開端生物寧靜性。
本部分將 Bio-CHSP NPs 納米溶液，經(jīng)尾靜脈注射于小鼠體內(nèi)，觀察動(dòng)物的體征、體重、食量及主要臟器病理切片，驗(yàn)證 Bio-CHSP 材料初步生物安全性。
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總結(jié)
膽甾化的普魯蘭糖（CHSP）具有良好的生物相容性，由于其具有兩親性，在水中可以通過疏水作用自聚集形成納米粒，是疏水性藥物尤其是抗腫瘤藥物的優(yōu)良載體。為設(shè)計(jì)其為靶向載體，通過酯化反應(yīng)，在 CHSP 材料上連接生物素靶頭，合成不同取代度的生物素化膽甾醇基普魯蘭糖（Bio-CHSP），并對其進(jìn)行表征。采用新型 Bio-CHSP 材料自聚集納米粒負(fù)載抗癌藥物米托蒽醌，考察其體外釋放；小鼠尾靜脈注射 Bio-CHSP納米溶液，初步評價(jià) Bio-CHSP 材料的生物安全性。全文總結(jié)如下：
1. 采用酯化反應(yīng)，將生物素化學(xué)鍵合到膽甾醇基普魯蘭糖分子鏈上，經(jīng) FT-IR、1H-NMR、 XRD 表征證明，成功合成不同取代度的生素素化膽甾醇基普魯蘭糖（Bio-CHSP），1H-NMR 法測定生物素取代度；透析法制備其自聚集納米粒，經(jīng)熒光光譜、透射電鏡及動(dòng)態(tài)光散射檢測，該材料可自聚集成粒徑均勻的 100~180 nm球形納米粒；穩(wěn)態(tài)熒光法測得臨界聚集濃度，其與生物素取代度具有負(fù)相關(guān)性。
2. 米托蒽醌（MTO）為模型藥物，制備表征負(fù)載 MTO 的 Bio-CHSP 材料納米粒。結(jié)果表明：MTO/Bio-CHSPNPs 包封率均超過 80%，粒徑均勻，載藥納米粒體外釋放，呈現(xiàn)雙相釋放，明顯延緩 MTO 的體外釋放，故 Bio-CHSP 可用作抗癌藥物的緩釋載體。
3. 通過尾靜脈注射 Bio-CHSP 納米粒溶液，對比小鼠的生長、食量及切片，綜合評價(jià) Bio-CHSP 材料的動(dòng)物體內(nèi)安全性。實(shí)驗(yàn)顯示：實(shí)驗(yàn)組與對照組沒有顯著差異，在 200mg/kg 小鼠尾靜脈注射 Bio-CHSP 納米溶液，未見明顯毒性。故初步證明 Bio-CHSP 材料具備一定生物安全性，為下一步的實(shí)驗(yàn)細(xì)胞及腫瘤靶向?qū)嶒?yàn)奠定基礎(chǔ)。
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參考文獻(xiàn)（略）
本文編號：10073
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