苯胺洛芬滴眼液新西蘭兔單次、多次滴眼給藥藥動(dòng)學(xué)的定量分析
【摘要】 研究目的為了給苯胺洛芬滴眼液的進(jìn)一步研究開發(fā)以及臨床推廣提供相應(yīng)的科學(xué)依據(jù)，本研究以新西蘭兔為實(shí)驗(yàn)對象，利用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS/MS）技術(shù)，對苯胺洛芬滴眼液新西蘭兔單次、多次滴眼給藥藥物代謝動(dòng)力學(xué)進(jìn)行研究。建立新西蘭兔眼部樣品（角膜、結(jié)膜、淚液、房水）中聯(lián)苯乙酸定量分析的LC-MS/MS方法；并準(zhǔn)確測定新西蘭兔單次、多次滴眼給藥苯胺洛芬滴眼液后眼部樣品中聯(lián)苯乙酸的濃度；最后根據(jù)測定的聯(lián)苯乙酸數(shù)據(jù)結(jié)果計(jì)算其相應(yīng)的藥物代謝動(dòng)力學(xué)參數(shù)，并對藥物代謝動(dòng)力學(xué)參數(shù)進(jìn)行相關(guān)分析，以此對苯胺洛芬滴眼液新西蘭兔單次、多次滴眼給藥后，苯胺洛芬在新西蘭兔眼內(nèi)的藥物代謝動(dòng)力學(xué)過程進(jìn)行科學(xué)評價(jià)。研究方案建立新西蘭兔眼部樣品（角膜、結(jié)膜、淚液、房水）中聯(lián)苯乙酸定量分析的LC-MS/MS方法。質(zhì)譜方法：電噴霧離子源，負(fù)離子掃描模式，多重反應(yīng)監(jiān)測，相應(yīng)定量離子對分別為聯(lián)苯乙酸m/z211.1m/z166.9、丙磺舒m/z283.9m/z239.9。液相方法：Venusil MP C18色譜柱（100mm×4.6mm I.D.,5um粒徑），乙腈-5mM乙酸銨溶液（含0.1%甲酸）（70:30，v/v）作為流動(dòng)相，40°C的柱溫箱溫度，30uL的進(jìn)樣量，每個(gè)樣品檢測分析時(shí)間僅為2.5min，內(nèi)標(biāo)為丙磺舒。樣品前處理方法：角膜、結(jié)膜組織樣品制備成勻漿液后進(jìn)行提取，濾紙片上的淚液樣品制備成萃取液后進(jìn)行提取，房水直接進(jìn)行提取。提取方法為液液萃取，提取試劑為乙醚：二氯甲烷（3:2，v/v）。本方法按照國家食品藥品監(jiān)督管理局（ChinaFood and Drug Administration，CFDA）指導(dǎo)原則要求，分別從線性范圍、最低定量下限、專屬性、精密度、準(zhǔn)確度、提取回收率、基質(zhì)效應(yīng)和樣品穩(wěn)定性等方面進(jìn)行完全方法確證。利用所建立的LC-MS/MS定量分析方法分別測定了新西蘭兔單次、多次滴眼給藥苯胺洛芬滴眼液后眼部樣品（角膜、結(jié)膜、淚液、房水）中聯(lián)苯乙酸的濃度，并且繪制了藥物濃度-時(shí)間曲線。根據(jù)藥物濃度-時(shí)間數(shù)據(jù)求出相關(guān)藥物代謝動(dòng)力學(xué)參數(shù)（達(dá)峰濃度、達(dá)峰時(shí)間、消除半衰期、藥-時(shí)曲線下面積），并對上述藥物代謝動(dòng)力學(xué)參數(shù)進(jìn)行相關(guān)分析，考察苯胺洛芬滴眼液新西蘭兔單次、多次滴眼給藥后，苯胺洛芬在新西蘭兔眼內(nèi)的藥物代謝動(dòng)力學(xué)特征。研究結(jié)果本研究建立了測定新西蘭兔眼部樣品（角膜、結(jié)膜、淚液、房水）中聯(lián)苯乙酸濃度的LC-MS/MS定量分析方法，該方法具有簡便、快速、靈敏、專屬性強(qiáng)、樣品用量少（100uL）等優(yōu)點(diǎn)。該方法在1-300ng/mL的范圍內(nèi)線性良好，最低定量下限可達(dá)到1ng/mL；待測物聯(lián)苯乙酸和內(nèi)標(biāo)丙磺舒的檢測不受內(nèi)源性物質(zhì)的干擾；方法的準(zhǔn)確度和精密度均滿足相關(guān)要求；樣品提取回收率高并且穩(wěn)定；待測物聯(lián)苯乙酸和內(nèi)標(biāo)丙磺舒的檢測不受基質(zhì)效應(yīng)的影響；樣品穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果表明：樣品經(jīng)反復(fù)凍融三次、-80°С放置3個(gè)月、處理前室溫放置4h、處理后室溫放置4h后均穩(wěn)定。本方法符合國家相關(guān)規(guī)范要求，能夠滿足臨床前藥物代謝動(dòng)力學(xué)研究的要求，可用于苯胺洛芬滴眼液新西蘭兔單次、多次滴眼給藥后藥物代謝動(dòng)力學(xué)的相關(guān)研究。苯胺洛芬滴眼液新西蘭兔單次滴眼給藥后，角膜、結(jié)膜、淚液和房水中待測物聯(lián)苯乙酸的各藥代參數(shù)如下：Cmax分別為4059.86±1128.98ng/g、725.13±196.49ng/g、54909.02±9014.14ng/g和272.39±51.62ng/mL；Tmax分別為0.08±0.00h、0.08±0.00h、0.08±0.00h和0.55±0.28h；t1/2分別為2.20±1.53h、2.25±1.67h、1.97±1.06h和3.43±0.32h；AUC0-t分別為8214.22±1375.48h·ng/g、3152.61±1117.28h·ng/g、43597.73±14526.74h·ng/g和667.95±37.28h·ng/g；AUC0-∞分別為8222.48±1991.46h·ng/g、3157.20±1147.21h·ng/g、43698.42±11348.42h·ng/g和668.59±40.58h·ng/g。苯胺洛芬滴眼液新西蘭兔多次滴眼給藥后，角膜、結(jié)膜、淚液和房水中待測物聯(lián)苯乙酸的各藥代參數(shù)如下：Cmax分別為5133.24±1556.24ng/g、1434.13±884.93ng/g、21828.41±8102.18ng/g和336.67±136.96ng/mL；Tmax分別為0.08±0.00h、0.08±0.00h、0.08±0.00h和0.46±0.10h；t1/2分別為2.25±1.55h、2.32±1.42h、2.07±1.20h和3.49±0.20h；AUC0-t分別為11659.91±3582.47h·ng/g、4081.22±1659.62h·ng/g、37547.48±1029.03h·ng/g和700.02±93.55h·ng/g；AUC0-∞分別為11660.38±3901.95h·ng/g、4088.62±1724.84h·ng/g、37581.26±1923.01h·ng/g和700.98±93.54h·ng/g。比較上述各藥代參數(shù)可知：苯胺洛芬滴眼液新西蘭兔多次滴眼給藥后，在角膜、結(jié)膜中可能有輕度蓄積傾向，臨床用藥應(yīng)多關(guān)注其藥物濃度和不良反應(yīng)；在房水中無蓄積傾向；多次滴眼給藥可能會刺激淚液分泌增多，使得淚液對藥物濃度起到了稀釋的作用。綜上所述，本研究為苯胺洛芬滴眼液的進(jìn)一步研究開發(fā)以及臨床推廣提供了相應(yīng)的科學(xué)依據(jù)。
第1章 前言
1.1 變態(tài)反應(yīng)性結(jié)膜炎
1.1.1 概述
變態(tài)反應(yīng)性結(jié)膜炎（allergic conjunctivitis，AC），又叫過敏性結(jié)膜炎，是一種影響眼表面的疾病[1]，其主要是眼結(jié)膜接觸外界變應(yīng)原引發(fā)的一種超敏反應(yīng)，通常與 I 型超敏反應(yīng)有關(guān)[2]。
超敏反應(yīng)（hypersensitivity）又稱變態(tài)反應(yīng)（allergy）。其實(shí)質(zhì)主要是一種病理性免疫應(yīng)答，故也具有特異性和記憶性，其與正常免疫應(yīng)答的區(qū)別在于機(jī)體在識別和排除抗原的同時(shí)，還造成機(jī)體的功能紊亂和/或組織損傷[3]。
Gell 和 Coombs 根據(jù)超敏反應(yīng)的發(fā)生機(jī)制和臨床特點(diǎn)，將其分為 4 型：I 型為速發(fā)型，又叫過敏反應(yīng)（anaphylaxis），主要由 IgE 抗體介導(dǎo)肥大細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞脫顆粒，釋放生物活性介質(zhì)作用于效應(yīng)器官而發(fā)��；II 型又稱細(xì)胞毒型或細(xì)胞溶解型；III 型又稱免疫復(fù)合物型或血管炎型；IV 型亦稱遲發(fā)型[4]。I、II和 III 型超敏反應(yīng)均由抗體介導(dǎo)，發(fā)生比較快，可經(jīng)血清被動(dòng)轉(zhuǎn)移；IV 型超敏反應(yīng)與 I、II 和 III 型超敏反應(yīng)不同，其主要是經(jīng)由 T 細(xì)胞介導(dǎo)的，轉(zhuǎn)移途徑主要是經(jīng)淋巴細(xì)胞被動(dòng)轉(zhuǎn)移，發(fā)生速度相對比較慢[5]。
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1.2 苯胺洛芬滴眼液概況
1.2.1 苯胺洛芬的理化性質(zhì)
苯胺洛芬是（1, 1’-二苯基）-4-乙酸（聯(lián)苯乙酸）與氨基丁三醇所成的鹽（C14H12O2 C4H11O3N，分子量為 333.37），為白色結(jié)晶粉末，易溶于甲醇，其中聯(lián)苯乙酸是本品的活性成分。鑒于苯胺洛芬可迅速解離為聯(lián)苯乙酸來發(fā)揮藥效，故本試驗(yàn)檢測的對象為苯胺洛芬的游離酸—聯(lián)苯乙酸，苯胺洛芬結(jié)構(gòu)式如圖 1 所示：
1.2.2 苯胺洛芬的藥理作用
解熱鎮(zhèn)痛抗炎藥（antipyretic-analgesic and anti-inflammatory drugs）是一類具有解熱、鎮(zhèn)痛，而且大多數(shù)還有抗炎、抗風(fēng)濕作用的藥物。鑒于其抗炎作用與糖皮質(zhì)激素不同且母體結(jié)構(gòu)中不含甾體結(jié)構(gòu)，故將這類藥又稱為非甾體類抗炎藥（non-steroidal anti-inflammatory drugs，NSAIDs）[23]。NSAIDs 主要的共同作用機(jī)制是抑制體內(nèi)環(huán)氧化酶活性來減少局部組織前列腺素（prostaglandin，PG）及血栓素的生物合成，從而產(chǎn)生解熱、鎮(zhèn)痛、抗炎及抗血小板聚集作
【學(xué)位級別】：碩士
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第2章 實(shí)驗(yàn)部分
2.1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)
2.1.1 藥品、試劑與儀器
藥品 純度>99.0%的聯(lián)苯乙酸尺度品，由廣州醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)研究院藥物非臨床評價(jià)研究中央提供；純度>99.0%的丙磺舒尺度品，由中國食品藥品檢定研究院（National Instisutes for Food and Drug Control）提供；受試制劑苯胺洛芬滴眼液（Binaprofen eye Drops），由某公司提供，批號：20120503，規(guī)格：5 mL-5 mg。
試劑 購自 SIGMA 中國有限公司的色譜純乙腈；分別購自天津天泰精細(xì)化學(xué)品有限公司、北京化工廠的分析純乙醚、二氯甲烷。超純水由本實(shí)驗(yàn)室 Milli-Q純水系統(tǒng)制得。
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2.2 分析方法確證
質(zhì)譜分析 使用甲醇-水(甲醇與水等比例混合)將待測物聯(lián)苯乙酸及內(nèi)標(biāo)丙磺舒充分溶解，然后按照“質(zhì)譜條件”項(xiàng)所示，設(shè)置質(zhì)譜各參數(shù)并進(jìn)行相應(yīng)質(zhì)譜分析，圖 2 即為獲得的相應(yīng)二級碎片掃描質(zhì)譜圖。
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第3章 數(shù)據(jù)結(jié)果分析.......................... 57-65
3.1 單次給藥.................. 57-61
3.2 多次給藥 ......................61-65
第4章 討論
4.1 LC-MS/MS 定量方法建立
4.1.1 LC-MS/MS 條件優(yōu)化
質(zhì)譜條件優(yōu)化
質(zhì)譜條件優(yōu)化是為了最大限度的提高檢測靈敏度，以滿足微量藥物準(zhǔn)確檢測的要求。本實(shí)驗(yàn)采用的掃描方式為多重反應(yīng)監(jiān)測（MRM），MRM 是 LC-MS/MS定量分析的標(biāo)準(zhǔn)方法。在摸索 MRM 方法時(shí)，采用蠕動(dòng)泵進(jìn)樣方式，流速20 uL/min。首先進(jìn)行母離子掃描，同時(shí)優(yōu)化解簇電壓（DP），從而獲得響應(yīng)高且穩(wěn)定的母離子；其次進(jìn)行子離子掃描，同時(shí)優(yōu)化碰撞能量（CE），從而獲得響應(yīng)高且穩(wěn)定的子離子；最后在 MRM 模式下優(yōu)化質(zhì)譜各參數(shù)。待測物聯(lián)苯乙酸和內(nèi)標(biāo)丙磺舒都是酸性物質(zhì)，在負(fù)離子掃描模式下離子化效率更高，獲得的信號響應(yīng)更高；在方法摸索中的確發(fā)現(xiàn)[M-H]-的信號響應(yīng)比[M+H]+高很多，所以選擇負(fù)離子掃描模式。最終獲得的定量離子對分別為：聯(lián)苯乙酸 m/z 211.1 m/z 166.9、丙磺舒 m/z 283.9 m/z 239.9。其它質(zhì)譜參數(shù)見“質(zhì)譜條件”項(xiàng)。
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結(jié)論
本研究建立了測定新西蘭兔眼部樣品（角膜、結(jié)膜、淚液、房水）中聯(lián)苯乙酸濃度的 LC-MS/MS 定量分析方法。本方法線性范圍較寬（1-300 ng/mL）；每個(gè)樣品分析測試時(shí)間短（僅為 2.5 min）；靈敏度高（LLOQ 為 1 ng/mL）；樣品采用液液萃取的提取方法，操作簡便快捷，大大節(jié)省了試驗(yàn)時(shí)間及成本；樣品用量少（僅為 100 uL），克服了房水取樣量少的難題；綜上所述，本方法具有分析時(shí)間短、專屬性強(qiáng)、準(zhǔn)確度高、靈敏度高的特點(diǎn)，完全符合國家相關(guān)規(guī)定，可用于苯胺洛芬滴眼液新西蘭兔單次、多次滴眼給藥藥物代謝動(dòng)力學(xué)研究。
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