【摘要】 本論文由兩部分獨(dú)立的研究內(nèi)容組成：第一部分研究催吐蘿芙木中生物堿的分離提取工藝、結(jié)構(gòu)測定和藥效學(xué)性質(zhì)，第二部分研究基于表面等離子共振技術(shù)平臺的傳感芯片再生制備技術(shù)以及槲寄生凝集素含量檢測。下面分別就這兩部分內(nèi)容進(jìn)行闡述。第一部分：催吐蘿芙木生物堿的提取工藝研究催吐蘿芙木是20世紀(jì)60年代自非洲加納引種至我國云南、廣西等地區(qū)的天然藥材植物。催吐蘿芙木的根部富含利血平、育亨賓等吲哚類生物堿，業(yè)已成為醫(yī)藥工業(yè)的重要原料。本課題在這樣的背景下，開發(fā)了催吐蘿芙木的新型分離提取工藝，采用本課題組自行設(shè)計(jì)裝配的制備型反相層析裝置，提取其中的生物堿成分，測定了10種生物堿成分的化學(xué)結(jié)構(gòu)，并初步考察了其中4種成分的降血壓活性與急性毒性。本部分共分為三章。第一章概述了蘿芙木屬植物所含藥用生物堿的研究現(xiàn)狀和催吐蘿芙木藥用生物堿分離提取工藝的現(xiàn)狀以及課題的意義與主要內(nèi)容。第二章建立了以酸性乙醇浸提、大孔樹脂吸附、大孔弱酸性陽離子交換樹脂提取、C18反相層析相結(jié)合，在實(shí)驗(yàn)室規(guī)模從催吐蘿芙木中提取生物堿的新型工藝。第三章采用超高效液相色譜-質(zhì)譜以及核磁共振等方法對從催吐蘿芙木中獲得的生物堿的化學(xué)結(jié)構(gòu)進(jìn)行測定，共鑒定了10種生物堿的化學(xué)結(jié)構(gòu)。通過腎動(dòng)脈結(jié)扎方法制作SD大鼠高血壓模型，考察了從催吐蘿芙木中分離提取出的4種組分的降血壓活性，用ICR小鼠測定了這些組分的急性毒性。第一部分工作的創(chuàng)新點(diǎn)主要有：（1）自行設(shè)計(jì)和裝配了制備型C18反相層析裝置，具有處理量大、回收率高、操作簡單等特點(diǎn)。試驗(yàn)表明，該裝置在天然產(chǎn)物的分離純化方面顯示出廣泛的適用性，有望通過進(jìn)一步深入開發(fā)進(jìn)入工業(yè)化生產(chǎn)領(lǐng)域。（2）本課題所建立的高產(chǎn)率的綜合提取工藝，可以同時(shí)分離純化10種不同的生物堿成分，所獲得的生物堿成分的收率、純度比傳統(tǒng)的工藝更高。（3）本課題開發(fā)設(shè)計(jì)的提取工藝中所使用的有機(jī)溶劑乙醇等均可再回收利用，比起現(xiàn)有分離提取方法，所使用的有機(jī)溶劑更少，對環(huán)境污染更低。第二部分：表面等離子共振（SPR）技術(shù)在槲寄生凝集素的應(yīng)用槲寄生凝集素是免疫調(diào)節(jié)的重要蛋白，近年來逐漸成為國內(nèi)外生物醫(yī)藥學(xué)的研究熱點(diǎn)。作為新興的生物傳感技術(shù)，SPR技術(shù)具有高靈敏度、高精確性的特點(diǎn)。本論文基于Plasmonic的SPR傳感器的平臺，探索了通過化學(xué)偶聯(lián)的方法制備4種不同類型的傳感芯片的技術(shù)，建立了一種操作簡單、節(jié)約時(shí)間和試劑的快速檢測槲寄生凝集素含量的方法；利用SPR技術(shù)考察了槲寄生凝集素對兩株細(xì)胞系A(chǔ)549和Calu-3的體外細(xì)胞毒作用。本部分共分為三章。第四章介紹了SPR傳感器的基本原理與本課題所使用的Plasmonic的SPR傳感器的構(gòu)造與操作方法，并闡述了槲寄生凝集素目前的研究現(xiàn)狀以及課題的意義與主要內(nèi)容。第五章設(shè)計(jì)了通過化學(xué)偶聯(lián)的方法制備4種不同類型的傳感芯片的方法，進(jìn)一步擴(kuò)大了SPR傳感器在生物領(lǐng)域的應(yīng)用范圍。建立了針對I型槲寄生凝集素（ML-I）樣品的三明治型抗體反應(yīng)體系測定方法，并可分別用于緩沖液、血清樣品及市售針劑中ML-I含量的檢測，具有用于醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)以及藥廠質(zhì)量控制的潛在應(yīng)用價(jià)值。第六章基于SPR技術(shù)平臺，以兩株細(xì)胞系A(chǔ)549和Calu-3為研究對象，初步考察了ML-I對其體外毒性作用。第二部分工作的創(chuàng)新點(diǎn)主要有：（1）設(shè)計(jì)、改良了基于Plasmonic傳感器技術(shù)平臺的不同類型的傳感芯片制備再生方法，具有程序簡單、操作方便的特點(diǎn)。（2）首次報(bào)道使用SPR傳感器測定槲寄生凝集素樣品含量的方法，具有新穎性強(qiáng)、試劑用量少、節(jié)約時(shí)間的特點(diǎn)，且重復(fù)性好。 

第一部分：催吐蘿芙木生物堿的提取工藝研究

第一章緒論
1.1蘿芙木屬藥用生物堿的研究現(xiàn)狀
蘿芙木（Rauvolfia）系夾竹桃科蘿芙木屬的常綠小灌木，廣泛分布于熱帶及亞熱帶地區(qū)。其屬名是為了紀(jì)念德國植物學(xué)家LeonhardRauwolf而得名，目前廣泛使用的中文名稱為其屬名的音譯。
在我國，蘿芙木屬植物是非常重要的傳統(tǒng)中藥材資源，其清熱、降壓、寧神的藥用價(jià)值很早就被民間發(fā)現(xiàn)，并被用于治療感冒發(fā)熱、頭痛身疼、眩暈、失眠、跌打損傷等疾病[1]。
1931年，印度化學(xué)家Siddiqui等首次對蘿芙木屬植物的化學(xué)成分進(jìn)行了研究，從蛇根木中分離并鑒定了不同的生物堿[2]。此后，越來越多的生物堿類化合物從蘿芙木中獲得。研究表明，蘿芙木主要含有利血平（reserpine）、育亨賓（yohimbine）、阿嗎靈（ajmaline，即蘿芙木堿rauwolfine）、阿嗎立新（ajmalicine）、利新胺（rescinnamine）、坎尼生（canescine）、羅尼生（raunescine）、蛇根堿（serpentine）、蛇根亭寧（serpentitine）等吲哚類生物堿[3~5]。其中，利血平、育亨賓、阿嗎靈的研究起步較早，研究深度與廣度也較突出；而其他的生物堿的研究亦在逐漸拓展。
1.1.1利血平的研究
利血平（reserpine）是蘿芙木中主要的藥用生物堿，在催吐蘿芙木中含量最高可達(dá)1%。有輕度降壓功能，作用緩慢而持久，對中樞神經(jīng)系統(tǒng)有鎮(zhèn)靜、安定作用，主要用于輕重度高血壓的治療[6]。
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1.2催吐蘿芙木藥用生物堿的提取工藝研究
催吐蘿芙木（RauvolfiavomitoriaAfzel）原產(chǎn)于非洲加納，1960年代引種至我國的云南、廣西等地，近年來獲得大面積的引栽種植[42]。
目前關(guān)于催吐蘿芙木的生物堿的提取工藝研究報(bào)道，一部分關(guān)注生物總堿的提取，所獲得的產(chǎn)物含有利血平、蘿芙木甲素等生物堿，其成分即為蘿芙木根部的弱堿性混合生物堿[43~45]；還有一部分報(bào)道的工藝只注重其中一種生物堿的提取，如利血平的提取，催吐蘿芙木的原料資源未能得到充分的利用[46~48]；此外還有一部分報(bào)道的研究目的在于分析而不是制備，操作步驟較繁瑣，收率低，不適合生產(chǎn)[49~51]。
本課題組多年來一直致力于蘿芙木屬植物的生物堿資源利用方面的研究[48、52]，在傳統(tǒng)提取工藝的基礎(chǔ)上進(jìn)行了創(chuàng)新改進(jìn)，開發(fā)了新型利血平分離提取工藝，分別取得小試、中試規(guī)模實(shí)驗(yàn)的成功。此外，在現(xiàn)有的利血平提取工藝的基礎(chǔ)上，研究從同一批催吐蘿芙木原料中提取利血平和育亨賓的新工藝，并取得了階段性的實(shí)驗(yàn)成果，已經(jīng)成為規(guī)�；I(yè)生產(chǎn)的重要參考依據(jù)，有望通過進(jìn)一步的科技成果轉(zhuǎn)化，實(shí)現(xiàn)經(jīng)濟(jì)效益的產(chǎn)出。

第二章催吐蘿芙木有效成分的分離提取

引言：
本課題的研究目標(biāo)為建立從催吐蘿芙木中同時(shí)獲得利血平、蛇根堿、阿嗎靈等生物堿單體的分離提取工藝，并為實(shí)現(xiàn)大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)提供必要的參考依據(jù)。在已建立的利血平、育亨賓提取工藝的基礎(chǔ)上[1~3]，我們認(rèn)為酸性乙醇浸提、大孔樹脂吸附和洗脫步驟已經(jīng)成為提取分離生物堿類化合物的有效步驟。但是，在獲得含有生物堿組分的洗脫液之后，如何進(jìn)一步提純，獲得純凈的生物堿化合物單體，是整個(gè)催吐蘿芙木生物堿提取工藝中的最關(guān)鍵步驟，也是本課題研究中創(chuàng)新性最高的技術(shù)環(huán)節(jié)。
通過本課題的前期研究工作，我們發(fā)現(xiàn)溶劑萃取、薄層層析、硅膠柱層析等常用的分離純化天然產(chǎn)物有效成分的方法在此并不適用[4~6]。在本課題的研究中，由于從催吐蘿芙木中浸提出的生物堿組分過于復(fù)雜，增加了陽離子交換樹脂處理的步驟，對所獲得的含有生物堿組分的大孔樹脂洗脫液進(jìn)行分離純化。此外，我們還考察了電層析和反相層析這兩種分離方法的純化效果。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，以羧甲基纖維素作為分離介質(zhì)，加載生物堿粗提樣品，通電進(jìn)行電層析的過程中，液體在層析柱中流速較慢，且產(chǎn)生的焦耳熱過大，易破壞分解樣品，分離效果不明顯。而反相層析的方法，卻獲得了較為理想的分離結(jié)果。由此，在陽離子交換樹脂處理步驟后，直接以C18柱反相層析提取，通過梯度洗脫，分段收集洗脫液，將生物堿組分分離，然后通過有機(jī)溶劑結(jié)晶的方法，獲得純凈的生物堿單體。
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2.1材料與儀器
2.1.1材料
干燥的催吐蘿芙木根塊，由云南思茅偉農(nóng)植物制藥有限公司提供。育亨賓粗品，由陜西禾博天然產(chǎn)物有限公司提供。利血平和育亨賓標(biāo)準(zhǔn)品均購自美國sigma-aldrich公司。高效液相色譜用甲醇為色譜純，購自上海凌峰化學(xué)試劑有限公司。工業(yè)乙醇，購自常熟市楊園化工有限公司。氫氧化鈉、硫酸、丙酮、無水乙醇、甲醇、三氟乙酸，均為分析純，購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。
HZ-818大孔吸附樹脂，購自華東理工大學(xué)華震科技有限公司。D152大孔弱酸性陽離子交換樹脂，購自南開大學(xué)化工廠。1×2型強(qiáng)酸性陽離子交換樹脂，上海醫(yī)藥工業(yè)研究院提供。
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第二部分：表面等離子共振技術(shù)在槲寄生凝集素的應(yīng)用.............92-145
第四章緒論.............................92-109
4.1表面等離子共振技術(shù)概述.........................92-95
4.1.1表面等離子共振技術(shù)的基本原理..................92-93
4.1.2表面等離子共振技術(shù)的實(shí)驗(yàn)方法.......................93-94
4.1.3表面等離子共振技術(shù)的特點(diǎn)..................94-95
4.2Plasmonic表面等離子共振傳感器...............95-101
4.2.1樣品池.....................96
4.2.2自動(dòng)進(jìn)樣系統(tǒng)....................96-98
4.2.3光學(xué)檢測系統(tǒng)...........................98-100
4.2.4其他重要技術(shù)參數(shù)....................100-101
4.3槲寄生凝集素的研究現(xiàn)狀................101-103
4.3.1槲寄生類植物的藥用成分................101-102
4.3.2槲寄生凝集素的類型....................102-103
4.4課題意義...........................103-104
4.5課題的主要工作....................104
參考文獻(xiàn)..................................104-109
第五章表面等離子共振技術(shù)在槲寄生凝集素檢測中的應(yīng)用........109-133
引言.............................109
5.1材料與儀器...............109-110
5.2實(shí)驗(yàn)方法.........................110-115
5.2.1傳感芯片的制備........................110-114
5.2.2傳感芯片的選擇...................114
5.2.3ML-I樣品的測定...................114-115
5.2.4市售針劑樣品的測定........................115
5.3實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論.......................115-129
5.3.1傳感芯片的制備..............115-117
5.3.2傳感芯片的選擇.....................117-121
5.3.3抗體反應(yīng)體系的確定............................121-122
5.3.4磷酸鹽緩沖液體系中ML-I樣品的測定..............122-125
5.3.5血清體系中ML-I樣品的測定..............125-128
5.3.6市售針劑中ML-I樣品的測定......................128-129
5.4本章小結(jié)..........................129
參考文獻(xiàn).............................129-133

第六章基于表面等離子共振技術(shù)的槲寄生凝集素的體外細(xì)胞毒作用考察

引言：
近年來，基于SPR技術(shù)的活體細(xì)胞研究工作不斷深入。根據(jù)SPR生物傳感器與細(xì)胞間反應(yīng)的原理可知，當(dāng)細(xì)胞本身受到外部刺激的影響而導(dǎo)致活性的變化時(shí)，通常細(xì)胞形態(tài)也會(huì)發(fā)生相應(yīng)的變化，因此使細(xì)胞膜與SPR生物傳感器的Au膜之間的折射率發(fā)生變化，宏觀上則體現(xiàn)在SPR檢測信號的變化[1、2]。
在這一前提下，Chabot等[3]以人胚腎（HumanEmbryonicKindey）HEK293細(xì)胞系為研究對象，使用SPR生物傳感器評估了細(xì)胞3種類型外部因子內(nèi)毒素（脂多糖）、化學(xué)毒素（疊氮化鈉）和生理激動(dòng)劑（凝血酶）刺激下的反應(yīng)。由相差顯微鏡的鏡檢結(jié)果與SPR檢測信號結(jié)果比較后發(fā)現(xiàn)，經(jīng)內(nèi)毒素處理的細(xì)胞發(fā)生死亡，導(dǎo)致SPR檢測信號劇烈變化；經(jīng)疊氮化鈉處理的細(xì)胞體收縮，也導(dǎo)致了SPR檢測信號的變化；凝血酶誘導(dǎo)的細(xì)胞反應(yīng)顯示出了測量激光反射率的迅速下降，5min后又恢復(fù)至原始值。Yanase等[4]觀察后發(fā)現(xiàn)，當(dāng)大鼠嗜堿性白血病細(xì)胞（ratbasophilicleukemiacells，RBL-2H3）在傳感芯片的表面培養(yǎng)并予以刺激時(shí)，可以檢測到SPR傳感器的反射角度（angleofresonance,AR）的變化；同樣，在表皮生長因子（epidermalgrowthfactor,EGF）的刺激下，小鼠角質(zhì)形成細(xì)胞PAM212的AR值也發(fā)生了變化。而導(dǎo)致這些變化的原因在于細(xì)胞內(nèi)的反應(yīng)，并通過共焦顯微鏡的觀察，證實(shí)了細(xì)胞黏附區(qū)域的變化。
在本章實(shí)驗(yàn)中，采用了Plasmonic公司制造的表面等離子共振器，以兩株細(xì)胞系A(chǔ)549和Calu-3為研究對象，初步考察了I型槲寄生凝集素（ML-I）對其體外毒性作用。
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結(jié)論

1．建立了酸性乙醇浸提、HZ-818大孔樹脂吸附、D152弱酸性陽離子交換樹脂純化、C18反相層析、結(jié)晶的提取工藝路線，從催吐蘿芙木中分離提取出10種生物堿成分，其中阿嗎靈、蛇根亭酸、蛇根堿、利血平、利新胺的純度較高，回收率高。
2．通過自行構(gòu)建腎動(dòng)脈結(jié)扎高血壓SD大鼠模型，對催吐蘿芙木中分離提取出的4種成分的降血壓活性進(jìn)行了考察：有機(jī)酸類物質(zhì)的降血壓作用不明顯；阿嗎靈和蛇根亭酸具有穩(wěn)定的降血壓作用；蛇根堿也有降血壓作用，但作用較弱。阿嗎靈的LD50為800mg/kg，有輕度毒性；所實(shí)驗(yàn)的其余幾種化合物的急性毒性都很小。
3．設(shè)計(jì)了用SPR傳感器測定I型槲寄生凝集素（ML-I）樣品的三明治型抗體反應(yīng)體系方法，并可分別用于緩沖液、血清樣品及市售針劑體系中ML-I含量的檢測，具有用于醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)以及藥廠的質(zhì)量控制的潛在應(yīng)用價(jià)值。
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本文編號：10217