本文關(guān)鍵詞：參與生理氧環(huán)境下人晶狀體上皮細(xì)胞氧化損傷關(guān)鍵基因的篩選與鑒定，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的:人晶狀體上皮細(xì)胞對維持人晶狀體組織正常生理功能起著極其重要的作用,當(dāng)其受到氧化損傷時,晶狀體內(nèi)部穩(wěn)態(tài)受到破壞,可能加快白內(nèi)障進(jìn)展。當(dāng)前對人晶狀體上皮細(xì)胞氧化損傷有較多的研究,但是仍然不能明確氧化損傷的來源、發(fā)病環(huán)節(jié)以及詳細(xì)的分子機制。最新的研究表明,生理條件下,人晶狀體上皮細(xì)胞處于低氧環(huán)境中,氧分壓約為3~7mmHg(1kPa=7.5mmHg),相當(dāng)于體積分?jǐn)?shù)1%的氧含量,生理氧狀態(tài)(physiological hypoxia)下的人晶狀體上皮細(xì)胞對氧濃度的變化較為敏感。而多數(shù)既往人晶狀體上皮細(xì)胞的研究都是在體積分?jǐn)?shù)21%的常規(guī)氧環(huán)境中完成,與生理狀態(tài)有較大差異。本研究旨在探討生理氧條件下培養(yǎng)的人晶狀體上皮細(xì)胞與常規(guī)氧環(huán)境下培養(yǎng)的人晶狀體上皮細(xì)胞在抗氧化能力上的差異,初步探討參與氧化損傷的關(guān)鍵基因的差異,為后續(xù)更深入的分子機制和功能研究奠定基礎(chǔ)。方法:1.人晶狀體上皮細(xì)胞系HLEB3復(fù)蘇并連續(xù)傳代培養(yǎng)至狀態(tài)穩(wěn)定后,分別置于體積分?jǐn)?shù)21%的常氧培養(yǎng)箱、體積分?jǐn)?shù)1%的低氧培養(yǎng)箱孵育24h,消化、超速離心后收集細(xì)胞上清分別檢測SOD、CAT酶活性以及GSH含量。兩種培養(yǎng)環(huán)境下的細(xì)胞分別接種至96孔板,與含H2O2濃度為0μmol/L,25μmol/L,50μmol/L,75μmol/L和100μmol/l的培養(yǎng)液共孵育24h,mtt檢測細(xì)胞活力。2.人晶狀體上皮細(xì)胞分為常氧實驗組、常氧對照組、生理氧實驗組和生理氧對照組,實驗組與含h2o2濃度為75μmol/l的培養(yǎng)液共孵育24h,對照組與不含h2o2的培養(yǎng)液共孵育24h。提取各組細(xì)胞總rna,質(zhì)檢合格后進(jìn)行microrna芯片檢測和表達(dá)譜芯片檢測。篩選出符合差異標(biāo)準(zhǔn)的microrna和mrna,并利用生物信息學(xué)技術(shù)對差異表達(dá)的mrna進(jìn)行聚類分析。對芯片檢測出的差異基因,用qrt-pcr鑒定其差異是否與芯片結(jié)果相符。結(jié)果:1.生理氧組細(xì)胞的sod酶活性、cat酶活性以及gsh含量分別為:124.36±6.48u/mgprotein,13.28±0.74u/mgprotein和136.63±5.21μg/ml。常氧組細(xì)胞的sod酶活性、cat酶活性以及gsh含量分別為:168.78±7.51u/mgprotein,15.02±0.86u/mgprotein和163.96±4.76μg/ml。常氧組細(xì)胞的sod酶活性高于生理氧組35.72%(p0.01,n=3),cat酶活性高于生理氧組13.10%(p0.05,n=3),gsh含量高于生理氧組20.02%(p0.001,n=3)。常氧組細(xì)胞在加入含h2o2濃度為0μmol/l,25μmol/l,50μmol/l,75μmol/l和100μmol/l的現(xiàn)配培養(yǎng)液培養(yǎng)24h后,細(xì)胞活力分別為100±4.98%,95.60±3.57%,86.40±7.02%,74.09±8.50%和44.59±5.25%。生理氧組細(xì)胞的活力分別為100±6.66%,86.40±4.12%,68.64±4.66%,53.63±6.03%和9.26±2.04%。常氧組細(xì)胞的活力在h2o2處理濃度為25μmol/l時高于生理氧組10.64%(p0.01,n=5),h2o2處理濃度為50μmol/l時高于生理氧組25.88%(p0.001,n=5),h2o2處理濃度為75μmol/l時高于生理氧組38.15%(p0.01,n=5),h2o2處理濃度為100μmol/l時高于生理氧組381.44%(p0.001,n=5)。2.microrna芯片檢測結(jié)果顯示:常氧對照組與常氧實驗組比較發(fā)現(xiàn),常氧條件下氧化損傷誘導(dǎo)mir-34b-5p,mir-630,mir-222-5p表達(dá)上調(diào),mir-15b-3p表達(dá)下調(diào);生理氧對照組與生理氧實驗組比較發(fā)現(xiàn),生理氧條件下氧化損傷誘導(dǎo)mir-630表達(dá)上調(diào),mir-335-3p表達(dá)下調(diào);生理氧對照組與常氧對照組比較發(fā)現(xiàn),生理氧環(huán)境誘導(dǎo)mir-210表達(dá)上調(diào);生理氧實驗組與常氧實驗組比較發(fā)現(xiàn),生理氧環(huán)境下氧化損傷誘導(dǎo)mir-145-5p,mir-193b-3p,mir-630,mir-210表達(dá)上調(diào)。qrt-pcr驗證mir-630,mir-210的表達(dá)量差異與芯片結(jié)果相符。3.mrna表達(dá)譜芯片及聚類分析結(jié)果顯示:1)常氧對照組與常氧實驗組比較,常氧條件下氧化損傷誘導(dǎo)367個mrna表達(dá)上調(diào),154個mrna表達(dá)下調(diào)。聚類分析結(jié)果顯示,上調(diào)的基因富集于310個相關(guān)分類中,富集值最高的分類為p53信號通路、細(xì)胞凋亡通路、細(xì)胞程序性死亡通路等,下調(diào)的基因富集于110個相關(guān)分類中,富集值最高的分類為細(xì)胞外基質(zhì)相關(guān)通路等。2)生理氧對照組與生理氧實驗組比較,生理氧條件下氧化損傷誘導(dǎo)867個mrna表達(dá)上調(diào),466個mrna表達(dá)下調(diào)。聚類分析結(jié)果顯示,上調(diào)的基因富集于430個相關(guān)分類中,富集值最高的通路為p53信號通路、細(xì)胞凋亡通路、細(xì)胞程序性死亡通路等,下調(diào)的基因富集于185個相關(guān)分類中,富集值最高的分類為細(xì)胞外基質(zhì)相關(guān)通路等。3)生理氧對照組與常氧對照組比較,生理氧條件下氧化損傷誘導(dǎo)319個mrna表達(dá)上調(diào),83個mrna表達(dá)下調(diào)。聚類分析結(jié)果顯示,上調(diào)的基因富集于202個相關(guān)分類中,富集值最高的分類為低氧反應(yīng)、細(xì)胞外基質(zhì)、糖代謝等,下調(diào)的基因富集于35個相關(guān)分類中,富集值最高的分類為細(xì)胞免疫反應(yīng)等。4)生理氧實驗組與常氧實驗組比較,生理氧條件下氧化損傷誘導(dǎo)501個mrna表達(dá)上調(diào),119個mrna表達(dá)下調(diào)。聚類分析結(jié)果顯示,上調(diào)的基因富集于352個相關(guān)分類中,富集值最高的分類為低氧反應(yīng)、細(xì)胞凋亡、氧化還原酶活力等,下調(diào)的基因富集于125個相關(guān)分類中,富集值最高的分類為細(xì)胞趨化、細(xì)胞遷移等。5)qrt-pcr驗證ddit4、edn1、egln1、vldlr、vegfa的表達(dá)量差異與表達(dá)譜芯片結(jié)果相符。結(jié)論:生理氧條件下培養(yǎng)的人晶狀體上皮細(xì)胞的抗氧化損傷能力弱于體積分?jǐn)?shù)21%的常規(guī)氧環(huán)境中培養(yǎng)的細(xì)胞。兩種培養(yǎng)環(huán)境下的細(xì)胞在受到氧化損傷時,在表達(dá)譜水平存在廣泛的差異,提示相應(yīng)的抗氧化損傷機制可能存在差異。在microrna水平上,兩種培養(yǎng)環(huán)境下的細(xì)胞在受到氧化損傷時其mir-630均有明顯的表達(dá)上調(diào),提示miR-630是參與氧化損傷分子機制的重要microRNA;生理氧環(huán)境下細(xì)胞miR-210的表達(dá)水平明顯高于常氧組細(xì)胞,而且生理氧實驗組細(xì)胞的miR-630表達(dá)量也顯著高于常氧實驗組,提示miR-210可能是導(dǎo)致兩種培養(yǎng)環(huán)境下的細(xì)胞抗氧化損傷機制差異的關(guān)鍵microRNA。兩個microRNA之間的相互作用,它們下游調(diào)控的的靶基因等還需要結(jié)合表達(dá)譜芯片結(jié)果以及更深入的分子機制及功能研究來闡明。
【關(guān)鍵詞】：人晶狀體上皮細(xì)胞 生理低氧 氧化損傷 microRNA mRNA
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R776.1
【目錄】：

• 縮略語表4-6
• 中文摘要6-10
• 英文摘要10-14
• 前言14-16
• 文獻(xiàn)回顧16-26
• 引言26
• 實驗一 建立生理氧環(huán)境下人晶狀體上皮細(xì)胞氧化損傷的模型26-36
• 1 材料26-28
• 2 方法28-31
• 3 結(jié)果31-33
• 4 討論33-36
• 實驗二 參與人晶狀體上皮細(xì)胞氧化損傷的關(guān)鍵基因的篩選與鑒定36-59
• 1 材料36-37
• 2 方法37-43
• 3 結(jié)果43-54
• 4 討論54-59
• 小結(jié)59-60
• 參考文獻(xiàn)60-65
• 個人簡歷和研究成果65-66
• 致謝66

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本文編號：287053