本文關(guān)鍵詞：埃莎霉素產(chǎn)生菌的分子育種及其分類的初步鑒定，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：必特螺旋霉素(BT)是利用基因工程技術(shù),將來源于耐熱鏈霉菌的異戊�；D(zhuǎn)移酶基因(ist)克隆至螺旋霉素產(chǎn)生菌染色體,所獲得的基因工程菌的發(fā)酵產(chǎn)物,目前BT已完成臨床試驗(yàn)研究,進(jìn)入新藥生產(chǎn)注冊申報(bào)階段,必特螺旋霉素是個(gè)多組分抗生素,是以異戊酰螺旋霉素(簡稱埃莎霉素)Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ三個(gè)組分為主成分,還含有其他�；菪顾氐男〗M分。研究表明,BT與埃莎霉素Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ三個(gè)單組分的抗菌活性沒有顯著差異。因此,埃莎霉素的單一組分可能與BT多組分具有同樣的抗菌效果。構(gòu)建埃莎霉素霉素單組分(IA-Ⅰ)產(chǎn)生菌對簡化生產(chǎn)工藝、質(zhì)量控制及制劑改良均有重要的社會和經(jīng)濟(jì)意義。本實(shí)驗(yàn)室利用基因阻斷技術(shù),已構(gòu)建了只產(chǎn)生埃莎霉素Ⅰ組分的菌種WSJ-2。但是,該菌種發(fā)酵單位很低,不利于進(jìn)行規(guī)模化生產(chǎn)。 已知來源于碳霉素(16元大環(huán)內(nèi)酯抗生素)產(chǎn)生菌耐熱鏈霉菌的異戊�；D(zhuǎn)移酶基因ist與調(diào)節(jié)基因acyB2連鎖,調(diào)節(jié)基因的存在可以激活ist基因的表達(dá)；只有含有完整ist和acyB2調(diào)節(jié)基因才能在變鉛青鏈霉菌表達(dá)ist的活性,但是,迄今為止沒有異源轉(zhuǎn)入ist和acyB2基因可以直接提高抗生素產(chǎn)量或單組分含量的報(bào)道。本研究的目的是利用ist-acyB2連鎖基因,同時(shí)采用基因穩(wěn)定整合表達(dá)系統(tǒng),對WSJ-2實(shí)施分子育種,以提高產(chǎn)生菌埃莎霉素Ⅰ組分的含量及產(chǎn)量。 我們首先構(gòu)建了含有4”-異戊�；D(zhuǎn)移酶基因ist和耐熱鏈霉菌調(diào)節(jié)基因acyB2連鎖片段的重組質(zhì)粒pSET152-ia,然后將其導(dǎo)入到埃莎霉素Ⅰ產(chǎn)生菌WSJ-2中,通過pSET152載體上attp附著位點(diǎn)整合到WSJ-2的染色體上,獲得了新的埃莎霉素Ⅰ組分產(chǎn)生菌WSJ-IA。在一定發(fā)酵條件下,WSJ-IA發(fā)酵產(chǎn)量比原株WSJ-2提高4.14倍,產(chǎn)生埃莎霉素Ⅰ組分含量比原株提高3.47倍。所獲得的新的埃莎霉素Ⅰ組分產(chǎn)生菌WSJ-IA在不加藥條件下連續(xù)傳代,抗性表達(dá)穩(wěn)定,其發(fā)酵產(chǎn)量及組分含量基本穩(wěn)定。本研究結(jié)果表明,耐熱鏈霉菌ist-acyB2連鎖基因可以明顯提高埃莎霉素Ⅰ的組分含量和發(fā)酵產(chǎn)量,同時(shí),所獲得的WSJ-IA產(chǎn)生菌在為今后將BT開發(fā)為單組分有效新抗生素中的應(yīng)用及探討ist外源基因在螺旋霉素宿主菌中的調(diào)控機(jī)制奠定基礎(chǔ)。 必特螺旋霉素(BT,原名生技霉素)是利用基因工程技術(shù)研制的以4”位異戊酰螺旋霉素Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、為主要成分的�；菪顾亍０Ｉ顾�(異戊酰螺旋霉素)Ⅰ是在BT基礎(chǔ)上利用基因工程技術(shù)創(chuàng)制的BT中單一組分的抗生素。 本研究第一部分利用調(diào)節(jié)基因acyB2激活異戊�；D(zhuǎn)移酶(ist)基因表達(dá)的特點(diǎn),將ist與調(diào)節(jié)基因acyB2連鎖導(dǎo)入埃莎霉素Ⅰ產(chǎn)生菌,獲得埃莎霉素Ⅰ單組分的高含量及高產(chǎn)量菌株WSJ-IA。由于WSJ-IA在今后開發(fā)為單組分有效新抗生素中具明顯的潛在能力。BT及埃莎霉素Ⅰ產(chǎn)生菌在構(gòu)建中經(jīng)過多次染色體基因工程及誘變改造,為了考察菌種的遺傳穩(wěn)定性,并在今后生產(chǎn)中有效地保護(hù)生產(chǎn)菌種,有必要對它及其出發(fā)菌株-螺旋霉素產(chǎn)生菌在分類中的地位給予確定。 鏈霉菌分類學(xué)研究是當(dāng)今的研究熱點(diǎn),近年以鏈霉菌種屬16S rRNA序列保守性作為分子分類學(xué)標(biāo)志的研究發(fā)展迅速,但是,已證明僅用16S rRNA序列作為分類標(biāo)志,許多種屬之間的關(guān)系仍然不清楚,因此,選用多個(gè)看家基因保守序列作為分子標(biāo)志,可以比較清楚的確定鏈霉菌的種屬地位。 本研究對WSJ-IA及BT原株-螺旋霉素產(chǎn)生菌Streptomyces spiramyceticus F21進(jìn)行了初步鑒定。從形態(tài)學(xué)、培養(yǎng)和生理生化特征、細(xì)胞壁化學(xué)組成、16S rRNA基因序列、5個(gè)看家基因(atpD、gyrB、rpoB、recA和trpB)蛋白分析和系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建等方面對該菌株及其原株進(jìn)行了鑒定。結(jié)果表明兩株菌在形態(tài)培養(yǎng)特征、生理生化特征、細(xì)胞壁化學(xué)組成、16S rRNA基因序列和5個(gè)看家基因蛋白水平基本一致,在系統(tǒng)發(fā)育樹分析中同處在一個(gè)分支中。而在16S rRNA基因序列和5個(gè)看家基因蛋白水平在系統(tǒng)發(fā)育上它們均與已知相近菌株處于不同的分支上,并且不同基因與之相近菌株各有不同,相似菌株中無一報(bào)道產(chǎn)生螺旋霉素。說明Streptomyces spiramyceticus F21可能是一個(gè)產(chǎn)生螺旋霉素的鏈霉菌新種,16S rRNA基因序列和5個(gè)看家基因蛋白序列分析可以作為埃莎霉素Ⅰ基因工程菌生產(chǎn)過程中進(jìn)行鑒別的分子標(biāo)志。同時(shí),本研究為在長期大規(guī)模生產(chǎn)中應(yīng)用分子標(biāo)志考察鏈霉菌基因工程菌株的遺傳穩(wěn)定性提供了依據(jù)。
【關(guān)鍵詞】：埃莎霉素Ⅰ產(chǎn)生菌 4”-異戊酰基轉(zhuǎn)移酶基因(ist) 調(diào)節(jié)基因acyB2 埃莎霉素(異戊酰螺旋霉素)Ⅰ Streptomyces spiramyceticus F21 16S rRNA基因 多相分類
【學(xué)位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R378
【目錄】：

• 第一部分 利用調(diào)節(jié)基因進(jìn)行必特螺旋霉素單組分(埃莎霉素)產(chǎn)生菌的分子育種7-42
• 中文摘要7-8
• Abstract8-10
• 前言10-16
• 1 必特螺旋霉素概述10-11
• 2 基因工程育種抗生素產(chǎn)生菌研究進(jìn)展11-14
• 3 本論文研究目的和意義14
• 4 論文研究內(nèi)容和技術(shù)路線14-16
• 實(shí)驗(yàn)材料16-20
• 1. 生物信息學(xué)分析工具16
• 2. 菌種16
• 3. 基因和載體16
• 4. 試劑與工具酶16-17
• 5. 實(shí)驗(yàn)儀器17-18
• 6. 培養(yǎng)基18-19
• 7. 常用緩沖液19-20
• 實(shí)驗(yàn)方法20-27
• 1. E.coli質(zhì)粒DNA小量提取20-21
• 2. E.coli質(zhì)粒DNA大量提取21
• 3. 限制酶切反應(yīng)21
• 4. DNA電泳及片段回收21
• 5. DNA連接反應(yīng)21
• 6. E.coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞的制備21-22
• 7. 質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化E.coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞22
• 8. E.coli轉(zhuǎn)化子的驗(yàn)證22
• 9. 鏈霉菌原生質(zhì)體的制備、再生及DNA轉(zhuǎn)化原生質(zhì)體22-23
• 10. 鏈霉菌總DNA提取方法23
• 11. 少量快速提取鏈霉菌總DNA23-24
• 12. PCR反應(yīng)24-25
• 13. 測序25
• 14. 菌株篩選、發(fā)酵及發(fā)酵液的提取25
• 15. 抗生素生物效價(jià)測定25-26
• 16. 高效液相色譜分析26-27
• 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論27-41
• 1. 含ist-acyB2連鎖基因重組質(zhì)粒pSETl52-ia的構(gòu)建27-32
• 2. E.coli ET 12567/PUZ8002(pSET152-ia)陽性轉(zhuǎn)化子的篩選和鑒定32-33
• 3. acyB2基因整合型工程菌WSJ-IA的篩選和鑒定33-34
• 4. WSJ-IA菌種發(fā)酵產(chǎn)生埃莎霉素Ⅰ組分的檢測34-36
• 5. WSJ-IA遺傳穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)36-38
• 討論38-41
• 小結(jié)41-42
• 第二部分 基因工程埃莎霉素Ⅰ產(chǎn)生菌以及出發(fā)菌株-螺旋霉素產(chǎn)生菌分類的初步鑒定42-82
• 中文摘要42-43
• Abstract43-45
• 前言45-52
• 1. 必特螺旋霉素單組分-埃莎霉素Ⅰ概述45-46
• 2. 放線菌分類學(xué)研究進(jìn)展46-50
• 3. 本論文的研究目的和意義50
• 4. 論文的研究內(nèi)容和技術(shù)路線50-52
• 實(shí)驗(yàn)材料52-54
• 1. 生物信息學(xué)分析工具52
• 2. 菌種來源52
• 3. 主要試劑52
• 4. 主要儀器52
• 5. 培養(yǎng)基52-54
• 實(shí)驗(yàn)方法54-60
• 1. 菌株的形態(tài)和培養(yǎng)特征觀察54
• 2. 菌株生理生化特征測定54-55
• 3. 菌株細(xì)胞壁化學(xué)組成分析55-56
• 4. 基于菌株16SrRNA基因序列的系統(tǒng)發(fā)育分析56-58
• 5. 基于菌株看家基因蛋白序列的系統(tǒng)發(fā)育分析58-60
• 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論60-81
• 1. 菌株的形態(tài)和培養(yǎng)特征觀察結(jié)果60
• 2. 生理生化特征實(shí)驗(yàn)結(jié)果60-62
• 3. 細(xì)胞壁化學(xué)成分分析62
• 4. 基于菌株16S rRNA基因序列的系統(tǒng)發(fā)育分析62-67
• 5. 基于菌株看家基因部分序列和蛋白序列的系統(tǒng)發(fā)育分析67-79
• 討論79-81
• 小結(jié)81-82
• 參考文獻(xiàn)82-89
• 綜述89-104
• 參考文獻(xiàn)99-104
• 英文縮略語104-106
• 附錄106-111
• 致謝111

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 高鵬,韓英,許國旺,趙春霞,戴兵,李萍,王運(yùn)鐸,溫杰,徐維家;Fluorescence-based Multiplex PCR-Single Strand Conformation Polymorphism (SSCP) Analysis of 16S Ribosomal DNA Using Capillary Electrophoresis[J];Journal of Microbiology and Immunology;2004年02期

2 馬利,張利平,趙剛勇;放線菌的多相分類法[J];河北省科學(xué)院學(xué)報(bào);2004年01期

3 余蘭香 ,劉京芳 ,徐曉雯 ,母立新 ,林赴田;生技霉素藥效學(xué)研究[J];四川生理科學(xué)雜志;1998年03期

4 王世偉,齊小輝,劉軍,馬玉超,周東坡;AFLP技術(shù)在微生物分類鑒定、基因標(biāo)定及遺傳多樣性方面的應(yīng)用[J];生物技術(shù);2003年05期

5 戴劍漉;李瑞芬;王以光;武臨專;赫衛(wèi)清;;響應(yīng)面法優(yōu)化必特螺旋霉素發(fā)酵培養(yǎng)基[J];沈陽藥科大學(xué)學(xué)報(bào);2010年06期

6 戴劍漉;林靈;武臨專;王以光;;埃莎霉素Ⅰ組分高含量、高產(chǎn)量基因工程菌WSJ-IA及其原株的鑒定[J];微生物學(xué)通報(bào);2012年04期

7 張妍;張建麗;牛寧昌;;放線菌的分子分類[J];微生物學(xué)雜志;2007年04期

8 劉垂s

本文編號：482382