本文關(guān)鍵詞：耐甲氧西林金黃色葡萄球菌主要流行克隆替代的機(jī)制研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus，簡稱金葡菌)是重要的人類病原菌，除可引起人類皮膚和軟組織化膿性感染外，尚可致肺炎、關(guān)節(jié)炎、骨髓炎、剝脫性皮炎、胃腸炎、膿毒血癥、毒性休克綜合征等多種疾病，嚴(yán)重危害人類健康。隨著抗生素在臨床的廣泛使用，金葡菌的耐藥性不斷增強(qiáng)，尤其是耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(methicillin-resistant Staphylococcus aureus，MRSA)的出現(xiàn)及其耐藥性的快速增長，目前已成為全球院內(nèi)獲得性感染的首要病原菌，引起全球衛(wèi)生領(lǐng)域的高度關(guān)注。美國2005年因MRSA感染導(dǎo)致的死亡人數(shù)就已經(jīng)超過乙型肝炎和艾滋病的總和；我國耐藥監(jiān)測網(wǎng)的12家醫(yī)院2011年向美國JMI實(shí)驗(yàn)室提供的2278株醫(yī)院感染細(xì)菌中，金葡菌分離率排第一位(占15.1%，343/2278)。有研究者將MRSA、HBV、HIV稱為當(dāng)前全球三大感染性病原微生物。 應(yīng)用金葡菌的分子分型方法，如葡萄球菌染色體盒(staphylococcal cassettechromosome mec， SCCmec)分型，染色體脈沖場凝膠電泳(pulsed-field gelelectrophoresis，PFGE)分析,多位點(diǎn)序列分型(multilocus sequence typing，MLST),以及葡萄球菌A蛋白基因分型(staphylococcal protein A gene typing, spa)等，對不同地區(qū)的流行分離株進(jìn)行分析后發(fā)現(xiàn)：特定地區(qū)的金葡菌感染主要由少數(shù)幾個(gè)優(yōu)勢克隆群(clonal complex, CC)引起。如美國流行的最主要金葡菌克隆群是USA300(CC8),英國等歐洲國家主要是CC22和CC30，而亞洲國家最主要的流行克隆群是ST239。Liu等(2009)對我國14個(gè)城市的MRSA菌株進(jìn)行分析鑒定發(fā)現(xiàn)，ST239是我國最主要的MRSA克隆群，占80.8%(567/702)。我們課題組前期對分離自重慶、上海、北京、廣州、沈陽、烏魯木齊等6城市的309株MRSA進(jìn)行分子分型研究也發(fā)現(xiàn)ST239占51.5%(159/309)。MRSA的分子流行病學(xué)研究還發(fā)現(xiàn)：特定地區(qū)流行的MRSA菌株克隆群不是恒定不變的，而是存在克隆群相互替代的現(xiàn)象。如在英國，CC22MRSA克隆群在2001~2007年間逐漸取代了CC30而成為最主要的流行克隆群；在德國，一家醫(yī)院經(jīng)過11年的監(jiān)測研究發(fā)現(xiàn), CC45-MRSA-IV和CC5/ST228-MRSA-I兩個(gè)克隆群逐步被CC22-MRSA-IV和CC5-MRSA-II所取代；在匈牙利，1994年到1998年之間最主要的流行MRSA克隆群為ST239，然而自2001年至2004年間被ST228和ST5克隆群所取代。我國最主要的ST239MRSA克隆群內(nèi)有2個(gè)優(yōu)勢克隆，ST239-MRSA-III-t037和ST239-MRSA-III-t030。研究發(fā)現(xiàn)，，2000年之前ST239-MRSA-III-t037為我國流行的第一大MRSA克隆，但2000年之后該克隆的地位被ST239-MRSA-III-t030克隆取代，這種克隆群之內(nèi)的克隆替代現(xiàn)象尚未在國際上其它地區(qū)發(fā)現(xiàn)，開展對其替代機(jī)制的研究，不僅對理解我國最主要克隆群內(nèi)克隆的更替有重要意義，而且可為針對性研發(fā)新型抗MRSA感染藥物提供重要參考依據(jù)。 MRSA克隆群或克隆的替代機(jī)制復(fù)雜，菌株本身的特性、抗生素的使用與選擇壓力、地理因素、人群流動(dòng)、環(huán)境因素、適應(yīng)性代價(jià)(fitness cost)等都可能對特定地區(qū)的MRSA克隆的變遷產(chǎn)生影響。在法國，研究者發(fā)現(xiàn)慶大霉素敏感的MRSA克隆(GS-MRSA clone)逐步取代了慶大霉素耐藥的克隆(GR-MRSA clone)(Laurent etal.2001)，說明MRSA會(huì)為對特定抗生素的耐藥性付出更多代價(jià)。Lee等(2007)研究發(fā)現(xiàn)，MRSA攜帶SCCmec元件的不同對菌株的適應(yīng)性也有影響，如攜帶SCCmec I型細(xì)菌比SCCmec IV型菌具有更強(qiáng)的葡萄糖代謝能力和相對高的生長速率，這也許是在臨床分離株中SCCmec I型MRSA菌比IV型更常見的原因。我國流行的ST239-MRSA-III-t037和ST239-MRSA-III-t030均攜帶同一種SCCmec，即SCCmec III，那么發(fā)生在我國的ST239-MRSA-III-t030替代ST239-MRSA-III-t037的機(jī)制也許更為復(fù)雜。本課題組前期從我國6座城市9所醫(yī)院的MRSA分離株中，鑒定出ST239-MRSA-III克隆株159株，其中ST239-MRSA-III-t030占56.6%(90/159)，ST239-MRSA-III-t037占30.2%(48/159)(Cheng et al.2013)。有趣的是，我們也發(fā)現(xiàn)大多數(shù)ST239-MRSA-III-t030菌株都對利福平耐藥而對復(fù)方新諾明敏感，而ST239-MRSA-III-t037菌株都對利福平敏感且大多數(shù)對復(fù)方新諾明耐藥，這一獨(dú)特的耐藥現(xiàn)象是否在我國MRSA克隆的替代中發(fā)揮作用尚不清楚。為探索我國ST239-MRSA-III-t030替代ST239-MRSA-III-t037而成為最主要流行克隆的機(jī)制，本研究從重慶、上海、廣州三個(gè)地區(qū)分離的ST239-MRSA-III-t030和ST239-MRSA-III-t037菌株隨機(jī)抽出24株(每地8株)配成12個(gè)t030/t037菌株對，采用生長曲線測定、體外競爭實(shí)驗(yàn)、交叉抑制實(shí)驗(yàn)，體內(nèi)競爭實(shí)驗(yàn)、耐藥性再檢測、耐藥決定簇分析及相關(guān)基因表達(dá)水平的檢測等方法，深入探討ST239-MRSA-III-t030克隆的生存優(yōu)勢以及與耐藥性的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)ST239-MRSA-III-t030較ST239-MRSA-III-t037有更強(qiáng)的生存能力，這種生存優(yōu)勢可能與ST239-MRSA-III-t030菌株普遍存在利福平耐藥，而ST239-MRSA-III-t037普遍存在復(fù)方新諾明耐藥有關(guān)。主要研究內(nèi)容和結(jié)果分述如下： 1. MRSA菌株耐藥譜的再測定：前期收集的為各臨床實(shí)驗(yàn)室的藥敏試驗(yàn)結(jié)果，為統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，采用BHI肉湯稀釋法檢測了24株MRSA對利奈唑胺，替考拉寧，萬古霉素,苯唑西林,克林霉素,利福平,復(fù)方新諾明的藥物敏感性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)24株菌株均對利奈唑胺，替考拉寧和萬古霉素敏感，對苯唑西林耐藥，有11株對克林霉素耐藥(CQ08除外)；12株ST239-MRSA-III-t030菌株都對利福平耐藥且均對復(fù)方新諾明敏感；相反，12株ST239-MRSA-III-t037菌株都對利福平敏感，其中11株對復(fù)方新諾明耐藥(SH02除外)。 2. MRSA菌株的生長曲線測定：采用TSB培養(yǎng)基，體外對12對金葡菌的生長曲線進(jìn)行檢測分析。結(jié)果11個(gè)MRSA菌株對中ST239-MRSA-III-t030菌株表現(xiàn)出顯著較短的生長遲緩期，培養(yǎng)24小時(shí)后能夠檢測到較高的OD600吸光度值。剩下一組(SH05/SH39)菌株的生長遲緩期雖然相似，但在培養(yǎng)24小時(shí)后ST239-MRSA-III-t030菌株也可以達(dá)到更高的OD600吸光度值。表明在獨(dú)立生長的情況下，ST239-MRSA-III-t030菌株較ST239-MRSA-III-t037生長更快，在培養(yǎng)24h后能達(dá)到更高的生長量。 3.體外競爭與交叉抑制實(shí)驗(yàn)：①將24株細(xì)菌的過夜培養(yǎng)物分別稀釋至0.5個(gè)麥?zhǔn)蠞舛�，各�?00μl按12個(gè)菌株對進(jìn)行1：1混合，接種于新鮮BHI培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)24小時(shí)，利用ST239-MRSA-III-t030和ST239-MRSA-III-t037對抗生素敏感性不同，采用稀釋鋪板計(jì)數(shù)法檢測混合培養(yǎng)后各克隆的菌落總數(shù)，計(jì)算t030/t037的比值。結(jié)果12對菌株中有9對ST239-MRSA-III-t030在培養(yǎng)24小時(shí)后菌落數(shù)目顯著高于ST239-MRSA-III-t037，還有1對的t030/t037的比值大于1，但差異不顯著，表明多數(shù)ST239-MRSA-III-t030菌株在同一環(huán)境條件下的競爭中存在優(yōu)勢。②將t030與t037菌株過夜培養(yǎng)上清中的蛋白用三氯醋酸沉淀后進(jìn)行SDS-PAGE分析，發(fā)現(xiàn)兩者的分泌蛋白存在很大差異，為證實(shí)一種菌分泌的蛋白是否對另一種菌的生長產(chǎn)生了抑制作用，我們用培養(yǎng)t030菌株7h或者4h的上清去培養(yǎng)t037,同時(shí)用培養(yǎng)t037菌株7h或者4h的上清去培養(yǎng)t030，通過這種交叉抑制實(shí)驗(yàn)，結(jié)果沒有發(fā)現(xiàn)MRSA t030與t037菌株之間存在交叉抑制作用，前述ST239-MRSA-III-t030在體外生存競爭的優(yōu)勢并非由于t030分泌了特定的抑制因子抑制了t037菌株生長而引起。 4.體內(nèi)競爭實(shí)驗(yàn)：為檢測ST239-MRSA-III-t030是否在體內(nèi)感染中也有競爭優(yōu)勢，隨機(jī)抽取2個(gè)t030/t037菌株對(CQ29/CQ40，SH08/SH02)，過夜培養(yǎng)后用PBS制備成1×108CFU/ml的菌液，各取50μl混合成菌株對，每對菌株經(jīng)小鼠尾靜脈感染5只Balb/c小鼠，3天后處死動(dòng)物，取腎臟，制成懸液，稀釋后采用鋪板計(jì)數(shù)法檢測每只小鼠腎臟中細(xì)菌的感染量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，兩個(gè)實(shí)驗(yàn)菌株對中ST239-MRSA-III-t030菌株在小鼠體內(nèi)每只腎臟中感染量分別達(dá)到了每顆腎臟(9.06±0.40)×106CFU和(9.01±0.42)×106CFU，顯著高于ST239-MRSA-III-t037菌株感染腎臟的(3.7±0.80)×106CFU和(4.48±0.69)×106CFU，表明ST239-MRSA-III-t030在小鼠體內(nèi)也較ST239-MRSA-III-t037有競爭感染優(yōu)勢。 5.耐藥決定簇及相關(guān)基因表達(dá)水平檢測：我國流行的MRSA克隆ST239-MRSA-III-t030和ST239-MRSA-III-t037在耐藥譜上主要表現(xiàn)在對利福平和復(fù)方新諾明耐藥性的差異，復(fù)方新諾明被我國MRSA感染防治專家委員會(huì)推薦為MRSA皮膚和軟組織感染以及深部根除性治療的藥物，而利福平的穿透力強(qiáng)，專家建議與穿透力弱或副作用較強(qiáng)的藥物，如萬古霉素等，聯(lián)合應(yīng)用于MRSA感染的根除性治療或手術(shù)的感染預(yù)防。①細(xì)菌對利福平的耐藥主要發(fā)生在RNA聚合酶β亞單位(RpoB)的基因突變，本研究對12株ST239-MRSA-III-t030的rpoB基因進(jìn)行了PCR擴(kuò)增和測序分析。結(jié)果顯示所有被測菌株都發(fā)生了RpoB L466S和H481N的氨基酸替換突變，使得t030菌株的利福平MIC值達(dá)到了512μg/ml甚至1024μg/ml。相對而言，復(fù)方新諾明通過干擾細(xì)菌的葉酸合成途徑，抑制細(xì)菌的DNA合成而殺菌，MRSA菌對復(fù)方新諾明的耐藥機(jī)制復(fù)雜，本研究對12株ST239-MRSA-III-t037菌株中可能與復(fù)方新諾明耐藥相關(guān)的基因，包括胸腺嘧啶核苷合成酶基因thyA；二氫葉酸還原酶基因dfrA；二氫葉酸合成酶基因dhps進(jìn)行了全基因的PCR擴(kuò)增和測序分析，結(jié)果在這3個(gè)基因中沒有任何堿基序列的突變，提示我國MRSA菌對復(fù)方新諾明的耐藥機(jī)制與國外報(bào)道的顯著不同，需要更多的研究進(jìn)行探索。②細(xì)菌發(fā)生耐藥性突變往往需要付出更高的適應(yīng)性代價(jià)(fitness cost),但MRSA對利福平的耐藥性突變，如RpoB H481N會(huì)因另一個(gè)位點(diǎn)的突變，如S529L,獲得適應(yīng)性補(bǔ)償(O’Neill et al.2006)，而且這種RpoB雙突變還會(huì)通過上調(diào)MRSA許多基因的表達(dá)來增強(qiáng)菌株的適應(yīng)性，我們隨機(jī)對2組(CQ29/CQ40，SH50/SH31)菌株培養(yǎng)至對數(shù)生長期的RNAIII基因和α-溶血素基因的表達(dá)水平進(jìn)行熒光定量RT-PCR檢測，結(jié)果顯示這些基因在ST239-MRSA-III-t030中的表達(dá)顯著高于ST239-MRSA-III-t037。雖本研究暫未檢測出ST239-MRSA-III-t037菌株耐復(fù)方新諾明的基因突變位點(diǎn)，但12株ST239-MRSA-III-t037中有8株在培養(yǎng)基上顯示生長受限，表現(xiàn)為小菌落(small colony varients, SCVs)形態(tài)，表明ST239-MRSA-III-t037對復(fù)方新諾明的耐藥需要付出更高的生存代價(jià)，這也許是臨床上ST239-MRSA-III-t037逐步被ST239-MRSA-III-t030替代的重要原因。 綜上所述，本研究選擇我國重慶、上海和廣州三個(gè)地區(qū)分離的ST239-MRSA-III-t030和ST239-MRSA-III-t037菌株進(jìn)行配對研究，從耐藥譜分析、生長曲線測定、體內(nèi)外競爭實(shí)驗(yàn)、交叉抑制實(shí)驗(yàn)、耐藥決定簇檢測及基因表達(dá)分析，發(fā)現(xiàn)ST239-MRSA-III-t030較ST239-MRSA-III-t037有更強(qiáng)的生存優(yōu)勢，初步闡明了我國ST239-MRSA-III-t030逐步替代ST239-MRSA-III-t037而成為最優(yōu)勢克隆的機(jī)制，對深入認(rèn)識(shí)MRSA的感染與流行，以及探索控制日益猖獗的MRSA感染新策略均有重要意義。
【關(guān)鍵詞】：耐甲氧西林金黃色葡萄球菌 利福平耐藥 復(fù)方新諾明耐藥 克隆替代
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R378.11
【目錄】：

• 縮略語表4-6
• Abstract6-12
• 摘要12-17
• 第一章 前言17-22
• 1.1 選題緣由17
• 1.2 研究背景17-19
• 1.3 研究意義19
• 1.4 研究內(nèi)容19-20
• 1.5 研究方法20-22
• 第二章 ST239-MRSA-III-t030/ST239-MRSA-III-t037 菌株生存特性研究22-39
• 2.1 材料與方法23-31
• 2.2 結(jié)果31-36
• 2.3 討論36-39
• 第三章 ST239-MRSA-III-t030 替代 ST239-MRSA-III-t037 的機(jī)制探討39-52
• 3.1 材料和方法40-45
• 3.2 結(jié)果45-50
• 3.3 討論50-52
• 全文總結(jié)52-54
• 參考文獻(xiàn)54-58
• 文獻(xiàn)綜述58-73
• 參考文獻(xiàn)68-73
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表的文章73-74
• 致謝74-75

【相似文獻(xiàn)】

中國博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 許夕海;安徽省合肥市2000-2010年流行性腦脊髓膜炎流行病學(xué)和分子流行病學(xué)研究[D];安徽醫(yī)科大學(xué);2014年

中國碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前2條

1 慈萌;基于CRD克隆群映射的克隆家系提取方法研究[D];哈爾濱工業(yè)大學(xué);2013年

2 尚偉龍;耐甲氧西林金黃色葡萄球菌主要流行克隆替代的機(jī)制研究[D];第三軍醫(yī)大學(xué);2014年

  本文關(guān)鍵詞：耐甲氧西林金黃色葡萄球菌主要流行克隆替代的機(jī)制研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：448705