本文關(guān)鍵詞：剛地弓形蟲14-3-3蛋白真核表達(dá)載體的構(gòu)建與表達(dá)，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：剛地弓形蟲是一種呈世界性分布的重要機(jī)會(huì)性致病原蟲,專性寄生細(xì)胞內(nèi),人與動(dòng)物均能感染,引起人獸共患弓形蟲病。正常情況下,宿主感染弓形蟲后,呈隱性狀態(tài)。但在宿主免疫功能低下時(shí),如器官移植、AIDS、惡性腫瘤等患者,弓形蟲可引起器官損害,導(dǎo)致嚴(yán)重后果。孕婦感染弓形蟲可致流產(chǎn)、死產(chǎn)和早產(chǎn),存活者也�；加谢魏椭橇φ系K等嚴(yán)重后遺癥。除感染人外,弓形蟲也可感染家畜,引起羊等多種家畜的流產(chǎn)和大量死亡,給全世界的畜牧業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失和影響其發(fā)展。同時(shí),帶蟲家畜是人感染弓形蟲的主要傳染源。 近年來,在真核細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)通路研究中,發(fā)現(xiàn)了一組關(guān)鍵信號(hào)蛋白14-3-3蛋白家族。14-3-3蛋白是廣泛存在于植物、酵母、原蟲、蠕蟲、昆蟲和包括人在內(nèi)的多種動(dòng)物真核細(xì)胞內(nèi)的一種高度保守蛋白。它參與很多細(xì)胞正常生命活動(dòng)的調(diào)節(jié)。據(jù)資料推測(cè),14-3-3蛋白也可能在弓形蟲細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中起重要的調(diào)節(jié)作用。 目的：構(gòu)建剛地弓形蟲RH株14-3-3蛋白的真核表達(dá)載體,并在真核細(xì)胞內(nèi)表達(dá)該載體,為研究弓形蟲中此蛋白的功能奠定基礎(chǔ)。 方法：首先利用生物信息學(xué)方法對(duì)弓形蟲14-3-3蛋白的理化性質(zhì)和結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)。用基因工程的方法,以弓形蟲RH株總RNA為模板,逆轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)擴(kuò)增目的基因片段。與pEASY-T1克隆載體連接,篩選出陽性克隆,經(jīng)PCR和雙酶切鑒定后,亞克隆至真核表達(dá)載體pEGFP-C1。經(jīng)過PCR、雙酶切和測(cè)序鑒定后,將構(gòu)建好的真核表達(dá)載體pEGFP/14-3-3轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞,用熒光顯微鏡觀察其在HEK293細(xì)胞內(nèi)表達(dá)情況,Western-blot鑒定表達(dá)產(chǎn)物。 結(jié)果：預(yù)測(cè)14-3-3蛋白分子為酸性可溶性蛋白。14-3-3二級(jí)結(jié)構(gòu)由Alpha helix(Hh)、Extended strand(E)e及Random coil(Cc)組成。3D結(jié)構(gòu)顯示14-3-3蛋白主要以同源或異源二聚體存在,形成一個(gè)U型結(jié)構(gòu)。14-3-3單體是由9個(gè)反向平行的a螺旋(Hh)構(gòu)成。發(fā)現(xiàn)約5個(gè)氨基酸保守序列區(qū),與結(jié)構(gòu)和功能相關(guān)的位點(diǎn)高度保守。RT-PCR擴(kuò)增出的基因片段約800bp,構(gòu)建的真核表達(dá)質(zhì)粒pEGFP/14-3-3經(jīng)PCR、雙酶切鑒定正確。測(cè)序結(jié)果表明,其具有一個(gè)801bp完整的開放閱讀框,與GenBank中剛地弓形蟲14-3-3蛋白基因序列(登錄號(hào)為AB012775.1)同源性為99%。熒光顯微鏡下觀察到重組質(zhì)粒能夠在HEK293細(xì)胞中表達(dá)。, Western-blot分析結(jié)果顯示,在轉(zhuǎn)染pEGFP/14-3-3重組質(zhì)粒的細(xì)胞中,存在表達(dá)的弓形蟲14-3-3蛋白,相對(duì)分子質(zhì)量約為30000。 結(jié)論：對(duì)14-3-3蛋白生物學(xué)信息預(yù)測(cè)及真核表達(dá)重組質(zhì)粒pEGFP/14-3-3的成功構(gòu)建,為下一步進(jìn)行14-3-3蛋白的研究奠定基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：剛地弓形蟲 14-3-3蛋白 真核表達(dá) 生物信息學(xué)
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號(hào)】：R382.5;Q78
【目錄】：

• 中文摘要6-8
• ABSTRACT8-10
• 符號(hào)說明10-12
• 前言12-17
• 材料17-20
• 試驗(yàn)方法20-36
• 結(jié)果36-44
• 討論44-47
• 參考文獻(xiàn)47-50
• 附圖50-51
• 致謝51-52
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文目錄52-53
• 附件53

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 都建,沈繼龍,王維,李小月,胡元生,鐘政榮,劉淼;弓形蟲信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白14-3-3的高效表達(dá)及免疫學(xué)診斷的初探[J];中國生物制品學(xué)雜志;2005年01期

  本文關(guān)鍵詞：剛地弓形蟲14-3-3蛋白真核表達(dá)載體的構(gòu)建與表達(dá)，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

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本文編號(hào)：446414